ICS 11.220 CCS B41 廊 1310 坊 市 地 方 标 准 DB 1310/T 272—2022 蛋禽 H7 亚型禽流感免疫抗体卵黄检测 技术规程 2022 - 08 - 10 发布 2022 - 09 - 10 实施 廊坊市市场监督管理局  发 布 DB 1310/T 272—2022 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由廊坊市农业农村局提出。 本文件起草单位：三河市金源禽业有限公司、三河市农业农村局。 本文件主要起草人：刘佳、张海燕、张凌凤、陈雪梅、李玉莹、张军英、马振刚、司文辉、王萃、 于明辉。 I DB 1310/T 272—2022 蛋禽 H7 亚型禽流感免疫抗体卵黄检测 技术规程 1 范围 本文件规定了蛋禽H7亚型禽流感免疫抗体卵黄检测技术中的术语和定义、样本抽取、实验准备、实 验方法、结果判定和免疫抗体合格判定等内容。 本文件适用于廊坊市辖区内采用卵黄进行蛋禽（鸡、鸭、鹅）H7亚型禽流感灭活疫苗免疫抗体检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 18936 高致病性禽流感诊断技术 GB/T 30642 食品抽样检验通用导则 DB13/T 946-2008 3 蛋禽 H5 亚型禽流感免疫抗体卵黄检测技术规程 术语和定义 DB13/T 946—2008界定的术语和定义适用于本文件。 4 样本抽取 人员要求 抽样人员不少于2人，并经过专业培训，掌握抽样程序和技术要求。抽样时需穿工作服、一次性鞋 套、口罩、手套，做好人员防护。 样本要求 抽取的禽蛋要具有代表性，以一栋禽舍或同一批次禽群为抽样单元，随机抽取蛋禽免疫接种H5+H7 亚型禽流感灭活疫苗21 d后所产的新鲜禽蛋。 抽样方式 4.3.1 笼养蛋禽 禽舍的首端、中端、尾端，鸡笼的每一层多点抽样。 4.3.2 非笼养蛋禽和蛋库 抽样按照GB/T 30642规定的程序和方法执行，确保抽样的公正性、真实性。 1 DB 1310/T 272—2022 样品的标记、保存和运输 4.4.1 样品的标记 抽样后填写采样单，抽样样品分为检测样品和复检备份样品，并在抽样过程中单独分装、封样。抽 取的样品应标明样品名称、日期、批号、数量、抽样人等信息，标记应牢固。 4.4.2 样品的保存和运输 将抽取的样品放置蛋托内避免样品破损，应贮藏在阴凉、干燥、通风、良好的场所。不得与有毒、 有害、有异味、易挥发、易腐蚀的物品同处贮藏。抽取的样品应立即送检，避免抽样、运输及装卸过程 中对样品的污染。 5 实验准备 材料准备 5.1.1 仪器设备 96孔90°V型微量反应板、100-1000ul单道微量移液器、5-50ul多道微量移液器、300ul滴头、1000ul 滴头、微量振荡器、低速离心机、液体快速混合器、1.5 ml离心管、30 ml容量瓶、60 ml容量瓶。 5.1.2 试剂 0.9%生理盐水、SPF 鸡红细胞混悬剂（1%）、禽流感病毒 H7 亚型 HI 抗原、禽流感病毒 H7 亚型阳 性血清和阴性血清。 检样制备 5.2.1 卵黄直接稀释 在样品管中加入0.5 ml生理盐水（0.9%），再吸取0.5 ml卵黄做1:1稀释，混匀制成卵黄检样备用。 5.2.2 卵黄氯仿萃取 取5.2.1制备好的卵黄检样0.4 ml加入等量氯仿,迅速用液体快速混合器充分振荡混匀，室温静置30 min，3000 r/min 离心5 min，取上清液备用。 6 实验方法 抗原血凝效价测定(HA 试验，微量法) 操作方法按GB/T 18936执行。 血凝抑制(HI)试验(微量法) 6.2.1 卵黄直接稀释测定法 操作方法按GB/T 18936执行。用5.2.1中制备的卵黄检样代替血清进行检测。检测时设标准阳性血 清和阴性血清对照。 2 DB 1310/T 272—2022 6.2.2 卵黄氯仿萃取测定法 6.2.2.1 适用范围 在卵黄直接稀释测定法检测出现跳管或测不出抗体时，采用卵黄氯仿萃取法检测。 6.2.2.2 方法 操作方法按GB/T 18936执行。用5.2.2中制备的检样代替血清进行检测。检测时设标准阳性血清和 阴性血清对照。 7 结果判定 试验结果成立条件 只有阴性对照孔血清滴度不大于2²，阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，试验结果才有效。 HI 滴度的计算方法 以完全抑制4个HAU抗原的样本最高稀释倍数作为HI滴度。样本制备过程中卵黄的稀释倍数和加入氯 仿量都计入该样本的稀释倍数。 判定方法 7.3.1 卵黄直接稀释测定法结果判定 将“检样制备”过程中样本的稀释倍数计入终点滴度判定，即:微最反应板上血凝抑制的终点滴度 加一个滴度为该样本的HI抗体效价，终点滴度为零时则不再加。举例：微量反应板上血凝抑制的终点滴 7 8 度是2 ，则该样本HI抗体效价为2 。 7.3.2 卵黄氯仿萃取测定法结果判定 将“检样制备”过程中样本的稀释倍数计入终点滴度判定，即:微量反应板上血凝抑制的终点滴度 加两个滴度为该样本的HI抗体效价，终点滴度为零时则不再加。举例:微量反应板上血凝抑制的终点滴 7 9 度是2 ，则该样本HI抗体效价为2 。 8 免疫抗体合格判定 个体合格判定 4 样本HI抗体效价大于等于2 为免疫合格。 群体合格判定 免疫合格样本数占检测总样本数≥70%判为群体合格。 3