ICS65.020.30 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 36191—2018 真鲷虹彩病毒病诊断规程 Protocol of diagnostic methods for red sea bream iridovirus disease(RsIVD) 2018-12-01实施 2018-05-14发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 36191—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由中华人民共和国农业农村部提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156）归口。 本标准起草单位：深圳出入境检验检疫局、中山大学、深圳市检验检疫科学研究院， 本标准主要起草人：兰文升、刘莹、于力、王津津、史秀杰、董传福、刘、贾鹏、郑晓聪、何俊强、叶奕优 王红英 GB/T 36191—2018 真鲷虹彩病毒病诊断规程 1范围 本标准规定了真鲷虹彩病毒病（Red seabreamiridovirusdisease，RSIVD)临床诊断、采样和病毒 分离鉴定和综合判定的方法。 本标准适用于水生动物真鲷虹彩病毒病的流行病学调查、诊断、检疫和监测 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法 GB/T18088出人境动物检疫采样 SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BLAST：局部序列比对检索工具（basiclocalalignment searchtool) bp：碱基对（basepair) CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammoniumbromide） CPE：细胞病变效应（cytopathiceffect) DMEM:Dulbeco Eagle's minimum essential medium EB：溴化乙锭（ethidiumbromide) FITC：异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate） IFAT：间接荧光抗体实验（indirectfluorescentantibodytest) ISKNV：传染性脾肾坏死病毒(infectiousspleenandkidneynecrosisvirus) MFF-1：鱼鱼苗细胞系（mandarinfishfrycellline) PBS：磷酸盐缓冲液（phosphatebufferedsaline） PBST：含0.05%吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液（0.05%tween+phosphatebufferedsaline) PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） RSIV：真鲷虹彩病毒（red seabreamiridoviralvirus) RSIVD：真鲷虹彩病毒病（redsea breamiridoviral disease) 试剂和材料 4.1水：符合GB/T6682中一级水的规格。 4.2 2RSIV参考株。 注：由农业部相关部门指定提供 1 GB/T36191—2018 4.3 3PCR反应试剂（dNTPs，Taq酶等），保存一20℃。 4.4 引物：引物浓度为20umol/L。 引物序列： 1-F:5'-CTC AAA CAC TCT GGC TCA TC-3'; 1-R:5-GCA CCA ACA CAT CTC CTA TC-3; 5MFF-1细胞系。 4.5 注：由农业部相关部门指定提供。 4.6 细胞培养液：含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液。 4.7胎牛血清（FBS）。 4.8 3抗RSIV的单克隆抗体（鼠源）。 注：由农业部相关部门指定提供。 4.9 异硫氰酸荧光素（FITC)标记的抗小鼠抗体。 5 器材和设备 器材和设备包括如下： a) 超净工作台。 b) 冷冻离心机。 c) 生化培养箱。 d) 普通冰箱和低温冰箱。 e) 荧光显微镜。 f) 倒置显微镜。 PCR仪。 g) h) 核酸电泳系统。 i) 凝胶成像仪。 6 临床诊断 6.1 临床症状 该病主要症状为鱼体色变黑，游动缓慢，呼吸加快，外表症状不明显，个别眼球突出、出血，体表出 血。内脏诸器官褪色，脾脏肿大。 6.2 组织病理检测 制备脾脏的印片或组织切片，经吉姆萨（Giemsa）染色，见附录A中A.1，患病样品镜检可见异常肿 大的细胞。 6.3 结果判定 6.3.1符合6.1的临床症状典型特征，并且经组织病理检测可见异常肿大的细胞，临床诊断结果阳性 6.3.2不符合6.1的临床症状典型特征，并且经组织病理检测未见异常肿大的细胞，临床诊断结果 阴性。 2 GB/T36191—2018 7采样 7.1采样对象 牙鲆、美国红鱼、真鲷、鱼和鱼等易感鱼类。 7.2采样数量 采样数量应符合SC/T7103的要求。 7.3样品采集 于6cm的鱼则取脾、肾、心脏、肠和鳃。 8病毒分离和鉴定 8.1病毒分离 8.1.1样品处理 每5尾鱼为1个样品，若有症状成鱼每1尾为1个样品。采集的组织样品（最少不低于5g）立刻研 8.1.2病毒分离培养 8.1.2.1将MFF-1细胞经细胞消化液（见A.2）消化后，加细胞培养液转接至96孔板，培养24h，制备 单层细胞，待用。 8.1.2.2将孵育的组织样品8000g离心15min，收集组织匀浆上清液 8.1.2.3组织匀浆上清液做10倍稀释，在无菌条件下，分别接种到MFF-1细胞的96孔板，每孔中加入 （未接种病毒的细胞），置于25℃～27℃培养 8.1.3细胞病变效应的观察 8.1.3.1倒置显微镜下观察细胞变化。 8.1.3.2被检样品接种7d后没有观察到CPE（阳性对照已出现CPE），需盲传一次。传代程序：将接种 细胞反复冻融，收集细胞培养液，8000g离心15min，上清液分别接种到新制96孔板的单层细胞中，继 续培养7d并观察。 8.1.3.3如果细胞培养板的孔中出现CPE，细胞培养液进行IFAT试验或PCR鉴定。 8.1.4结果判定 8.1.4.1 性对照出现CPE，阴性对照无CPE，则实验成立，否则，重新实验。 8.1.4.2如果病毒分离培养中出现CPE,则判定病毒分离结果阳性。 8.1.4.3如果病毒分离培养和盲传培养没有出现CPE，则判定病毒分离结果阴性。 3 GB/T 36191—2018 8.2 2聚合酶链式反应 8.2.1对照设置 以已知感染RSIV或ISKNV的鱼采集的组织样品作为阳性对照，以已知未感染RSIV或ISKNV 的健康鱼采集的组织样品作为阴性对照。 8.2.2DNA抽提 样品组织加约10倍体积灭菌生理盐水匀浆，取100μL组织匀浆，或者直接取出现CPE的细胞培 养液100μL，加人到有500μLCTAB溶液（见A.3）的1.5mL离心管中，65℃作用30min。然后加 20μL蛋白酶K（20mg/mL），55℃孵育30min。继续向离心管中加人600μL抽提液1（见A.4），震荡 混匀30s。12000g离心5min，取上层水相（约600μL）。加入600μL抽提液2（见A.5），震荡混匀30 S。12000g离心5min，小心取上层水相（约600μL）。加人1.5倍体积的预冷无水乙醇（900μL），上下 颠倒混匀后，放置一20℃冰箱8h以上。然后，12000g离心30min，弃上清液。将离心管倒置于吸水 纸上吸干残液，37℃干燥20min。加11μL～12μL水溶解后，作为PCR模板。 可使用等效的商业化试剂盒代替以上方法，操作步骤按照试剂盒操作手册进行。 8.2.3DNA扩增 8.2.3.1 引物的选用 在PCR扩增中，选用引物1-F和1-R,该对引物对RSIV和ISKNV基因组中的部分基因片段均可 有效扩增，产物大小为570bp(见附录B)。 8.2.3.2 反应体系 反应体系见表1。 表1PCR反应体系（50μL体系） 反应试剂 加样体积 抽提的模板DNA 4 μL 10×DNA聚合酶缓冲液（含20mmol/LMg2+） 5 μL dNTPMixture(各2.5mmol/L) 4 μL 1-F Primer(20 μmol/L) 1 μL 1-RPrimer(20 μmol/L) 1 μL DNA聚合酶（5U/μL） 1 μL 双蒸水 34 μL 总体积 50μL 注：反应体系可以根据比例相应扩大或者缩小。 8.2.3.3 PCR反应条件 95℃2min；94℃30s,58℃60s,72℃60s,30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。 4 GB/T 36191—2018 8.2.3.4电泳和基因测序 PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶成像仪观察结果。如果观察到结果阳性，对PCR扩 增产物进行基因测序，并将测序结果与参考序列（见附录B)进行比对，或在GenBank进行BLAST比对 分析。 8.2.4结果判定 8.2.4.1阳性对照样品能够扩增570bp片段，而阴性对照不能扩增出目的大小的核酸片段，表明实验 成立，否则实验不成立。 8.2.4.2扩增出大小为570bp片段，结合测序结果，判定PCR结果阳性， 8.2.4.3无扩增或扩增条带大小不是570bp，或测序结果不符，则判定PCR结果阴性。 8.3间接荧光抗体实验 8.3.1对照设置 用感染RSIV参考株的单层细胞作为