ICS07.080 CCSA40 中华人民共和国国家标准 GB/T46452—2025 腈水合酶纯度和活性的测定 Purityandenzymaticactivitydeterminationofnitrilehydratase 2025-10-05发布 2026-02-01实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会发布前 言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归口。 本文件起草单位:深圳市第二人民医院、江南大学、深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司、中国测试 技术研究院、北京衍微科技有限公司、清华大学、河北省食品检验研究院、中国计量测试学会。 本文件主要起草人:顾大勇、崔文璟、周哲敏、李卫峰、张译文、周李华、王苗苗、李付龙、王怡、张翀、 张岩、王旭、杨扬仲夫。 ⅠGB/T46452—2025 腈水合酶纯度和活性的测定 1 范围 本文件描述了腈水合酶纯度和活性测定的原理、试剂和材料、仪器设备、样品制备、试验步骤、结果 计算。 本文件适用于催化丙烯腈为丙烯酰胺的腈水合酶纯度和活性的测定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 腈水合酶 nitrilehydratase;NHase 具有将腈类物质(如丙烯腈)催化为酰胺类化合物(如丙烯酰胺)的金属酶。 注1:大部分NHase含有α,β两个亚基,一般以α2β2四聚体形式存在。 注2:NHase活性中心含有不同的金属离子,一般分为铁型腈水合酶(Fe-NHase)和钴型腈水合酶(Co-NHase)。 3.2 腈水合酶纯度 NHasepurity 腈水合酶蛋白相对纯度。 注:即腈水合酶检测灰度与样品蛋白总灰度的比值,结果以百分比(%)表示。 3.3 腈水合酶比活性 NHasespecificactivity 腈水合酶催化丙烯腈为丙烯酰胺的能力。 注:以酶的比活性单位(U/mg)来表示。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Acr-Bis:亚甲基双丙烯酰胺(acrylamide-bisacrylamide) APS:过硫酸铵(ammoniumpersulphate) BSA:牛血清白蛋白(bovineserumalbumin) LC:液相色谱(liquidchromatography) Nhase:腈水合酶(nitrilehydratase) 1GB/T46452—2025 PBS:磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline) SDS:十二烷基磺酸钠(sodiumdodecylsulfonate) SDS-PAGE:十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecylsulfonatepolyacrylamidegel electrophoresis) TEMED:四甲基乙二胺(tetramethylethylenediamine) Tris-HCl:三羟甲基氨基甲烷盐酸[tris(hydroxymethyl)aminomethanehydrochloride] 5 原理 以十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定蛋白纯度为例,一定浓度的十二烷基磺 酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在一定范围时间内,可分离不同分子量的蛋白,经染色、脱色、 成像及数据处理步骤,计算得腈水合酶的纯度。其他蛋白纯度的测定方法符合附录A、附录B的要求。 在适当条件下,腈水合酶等比催化丙烯腈生成丙烯酰胺,通过液相色谱外标法定量生成的丙烯酰 胺,根据酶活性单位定义计算得腈水合酶的比活性。 6 试剂和材料 除非另有规定外,本方法所用试剂均为分析纯,试验用水为GB/T6682规定的一级水。 6.1 0.3g/mL亚甲基双丙烯酰胺溶液(Acr-Bis)(按附录C的C.1)。 6.2 1.0mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液(Tris-HCl),pH=6.8(按C.2)。 6.3 1.5mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液(Tris-HCl),pH=8.8(按C.3)。 6.4 0.1g/mL十二烷基磺酸钠(SDS)溶液(按C.4)。 6.5 0.1g/mL过硫酸铵(APS)溶液(按C.5)。 6.6 10倍Tris-甘氨酸电极缓冲液(按C.6)。 6.7 5×十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)加样缓冲液(按C.7)。 6.8 染色液(按C.8)。 6.9 脱色液(按C.9)。 6.10 1.0mg/mL牛血清白蛋白标准溶液:用于蛋白含量检测(按C.10)。 6.11 0.1mol/L磷酸钾缓冲液(pH=7.4)(按C.11)。 6.12 10mmol/L磷酸钾缓冲液(pH=7.4)(按C.12)。 6.13 100mmol/L丙烯腈(按C.13)。 6.14 色谱纯乙腈。 6.15 100mmol/L丙烯酰胺(按C.14)。 6.16 有机微孔滤膜:孔径0.45μm。 6.17 液相色谱流动相(按C.14)。 7 仪器设备 7.1 电子天平。 7.2 离心真空浓缩仪。 7.3 金属浴。 7.4 旋涡振荡器。 7.5 酶标仪。 2GB/T46452—2025 7.6 蛋白电泳仪。 7.7 凝胶扫描装置。 7.8 脱色摇床。 7.9 移液器。 7.10 液相色谱仪,带有紫外可见光检测器(variablewavelengthdetector)或二极管阵列检测器(diode arraydetector)。 7.11 色谱柱,固定相为C18。 8 样品制备 准确称取适量待测样品,用10mmol/LPBS溶液溶解配制成1mg/mL和0.05mg/mL的样品 溶液。 9 试验步骤 9.1 蛋白质含量测定 按照附录D的方法测定样品中蛋白质含量。 9.2 腈水合酶纯度测定 9.2.1 电泳样品制备 分别精确移取100μL的1.0mg/mL待测样品和25μL的5×电泳(SDS-PAGE)加样缓冲液于一 个离心管中混合,100℃金属浴加热10min后,冷却备用。 9.2.2 电泳分离胶和浓缩胶的配制 组装制胶装置,按表1分别配置5%浓缩胶和12%分离胶溶液,蛋白胶孔容量为20μL。 表1 浓缩胶、分离胶配方 单位为微升 试剂 5%浓缩胶 12%分离胶 30%Acr-Bis 750 4000 1.5mol/LTris-HCl(pH=8.8) 0 2500 1.0mol/LTris-HCl(pH=6.8) 780 0 10%APS 60 100 10%SDS 60 100 水 4440 3400 TEMED 6 5 9.2.3 电泳上样 上样量为10μL,每个样品设3个重复。 3GB/T46452—2025 9.2.4 电泳 移液器移取10μL处理后待测腈水合酶样品,将样品点入凝胶加样孔中,待所有样品点样完成 后,开始电泳。样品位于浓缩胶时,电压调至80V的低电压,待样品进入分离胶后,电压调至120V。 当指示剂溴酚蓝运动至蛋白胶最下端时,电泳终止。结束后通过考马斯亮蓝R-250染色2h~4h。染 色后,将凝胶从染液中取出,放入脱色液进行脱色,期间使用脱色摇床振荡脱色,直至背景蓝色完全取 出,凝胶呈现透明,条带清晰可见,结束脱色。 9.2.5 纯度计算 电泳脱色后,凝胶置于凝胶成像系统中成像,根据实际情况选择适宜曝光度后拍照记录实验条带并 利用电泳图像分析软件进行分析处理,计算样品中腈水合酶所占比例(%),样品3个重复结果的平均值 与待测样品中所有蛋白条带总灰度的比值即为待测样品的实际平均相对纯度(用百分比表示)按照公式 (1)计算: P=R C×100% ……………………(1) 式中: P———待测腈水合酶平均相对纯度; R———待测样品腈水合酶所占的平均灰度; C———待测腈水合酶样品中所有蛋白总灰度。 计算结果保留小数点后两位。 9.3 腈水合酶比活性测定 9.3.1 液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下: 检测波长为:215nm; 柱温为:40℃; 流动相为:水/乙腈体积比为2∶1,等度洗脱; 进样量:2μL; 流速:0.2mL/min。 9.3.2 酶催化丙烯腈为丙烯酰胺 精确移取10μL质量浓度0.05mg/mL待测腈水合酶至1.5mL离心管中,置于25℃金属浴中。 向离心管中加入490μL浓度为100mmol/L丙烯腈作为底物,充分涡旋混匀,25℃条件下反应 10min,然后加入0.1mol/L磷酸溶液终止反应。移取上清液并过0.45μm有机系微孔滤膜。同时按 照表2分别配制浓度为0.5mmol/L、1mmol/L、2mmol/L、5mmol/L和10mmol/L的丙烯酰胺溶液 作为标样分别装载入LC样本室中(丙烯酰胺在HPLC检测中的保留时间见附录E)。 4GB/T46452—2025