ICS07.080 CCSA40 中华人民共和国国家标准 GB/T46451—2025 手性氨基酸的测定 柱前衍生高效 液相色谱串联质谱法 Determinationofchiralaminoacids—Highperformanceliquidchromatography tandemmassspectrometrywithpre-columnderivatization 2025-10-05发布 2026-05-01实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会发布前 言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归口。 本文件起草单位:深圳市计量质量检测研究院、深圳深检集团医学检验实验室、中国测试技术研究 院、深圳市药品检验研究院(深圳市医疗器械检测中心)、深圳市农产品质量安全检验检测中心、河北省 食品检验研究院、上海化工研究院有限公司、中国检验认证集团湖南有限公司、兰州百源基因技术有限 公司、中国计量测试学会、宜宾市检验检测中心。 本文件主要起草人:杨国武、李子樱、纪元、孙丽萍、唐淑军、刘成文、王进美、金一宝、罗敏、匡慧颖、 张玉鑫、周李华、王彧婕、张岩、史国华、雷雯、喻静兰、秦美蓉、李美芳、刘尧、王平、王奇、靳隆、苏佳婷、 黄城益、朱泽超、陈欣、赵云霞、肖伟敏、刘向荣、杨扬仲夫、车团结、刘涵、郑晓玲。 ⅠGB/T46451—2025 手性氨基酸的测定 柱前衍生高效 液相色谱串联质谱法 1 范围 本文件描述了采用柱前衍生高效液相色谱串联质谱法检测D-/L-丙氨酸、D-/L-丝氨酸、D-/L-脯氨 酸、D-/L-缬氨酸、D-/L-苏氨酸、D-/L-半胱氨酸、D-/L-亮氨酸、D-/L-异亮氨酸、D-/L-天冬酰胺、D-/L- 天冬氨酸、D-/L-谷氨酰胺、D-/L-谷氨酸、D-/L-组氨酸、D-/L-苯丙氨酸、D-/L-精氨酸、D-/L-色氨酸、 D-/L-赖氨酸、D-/L-鸟氨酸、D-/L-瓜氨酸、D-/L-羟基脯氨酸、D-/L-α-氨基己二酸、D-/L-磷酸丝氨酸、 D-/L-犬尿氨酸、D-/L-2-氨基丁酸、D-/L-甲硫氨酸和D-/L-酪氨酸的测定方法。 本文件适用于生化试剂、生物样本中上述游离手性氨基酸含量的测定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 游离手性氨基酸 freechiralaminoacids 没有与其他氨基酸结合构成蛋白质或肽类物质的天然游离态氨基酸。 注1:包括游离L-氨基酸和游离D-氨基酸。 注2:此类氨基酸不包括经化学或酶促水解蛋白质所产生的水解氨基酸。 4 原理 试样中的蛋白质经磺基水杨酸蛋白沉淀处理后,采用甲酸水溶液提取氨基酸,在三乙胺的催化下与 N-α-(5-氟-2,4-二硝基苯基)-L-丙氨酰胺发生衍生反应,衍生物用三重四极杆液相色谱串联质谱仪测 定,内标法定量。 5 试剂耗材 除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。 5.1 试剂 5.1.1 甲醇(CH3OH):CAS号95713-52-3。 1GB/T46451—2025 5.1.2 乙腈(C2H3N):CAS号75-05-8。 5.1.3 醋酸(C2H4O2):CAS号64-19-7。 5.1.4 乙酸铵(C2H7NO2):CAS号631-61-8。 5.1.5 丙酮(C3H6O):CAS号67-64-1。 5.1.6 三乙胺(C6H15N):CAS号121-44-8。 5.1.7 N-α-(5-氟-2,4-二硝基苯基)-L-丙氨酰胺(Marfey’sreagent,FDAA,C9H9FN4O5):CAS号 95713-52-3,纯度≥98%。 5.1.8 甲酸(CH2O2):CAS号64-18-6。 5.1.9 磺基水杨酸(C7H10O8S):CAS号5965-83-3。 5.2 试剂配制 5.2.1 10%乙腈水溶液:吸取10mL乙腈,加入纯水90mL,涡旋混匀。 5.2.2 0.1%甲酸水溶液:准确吸取甲酸(5.1.8)50.0μL于50mL容量瓶中,定容至刻度。临用现配。 5.2.3 10%磺基水杨酸水溶液:准确称取2.50g磺基水杨酸(5.1.9)用一级水溶解并转移至25mL容量 瓶中,定容至刻度,室温保存3个月。 5.2.4 3mg/mLFDAA衍生试剂:准确称取30.0mgFDAA(5.1.7)用丙酮溶解并转移至10mL容量 瓶中,定容至刻度,临用现配。 5.2.5 0.05mol/L三乙胺溶液:准确称取0.25g三乙胺用甲醇溶解并转移至100mL容量瓶中,定容至 刻度,避光室温保存3个月。 5.2.6 0.1mol/L醋酸溶液:准确称取0.60g醋酸用一级水溶解并转移至100mL容量瓶中,定容至刻 度,室温保存3个月。 5.2.7 10mmol/L乙酸铵水溶液:准确称取0.77g乙酸铵用一级水溶解并转移至1L容量瓶中定容至 刻度,临用现配。 5.3 标准物质/标准样品 L-/D-氨基酸标准物质/标准样品及稳定同位素内标物,纯度≥98%或有证标准物质/标准样品。 26对手持氨基酸的中文名称、英文名称、CAS号、分子式、相对分子质量等详见附录A。 5.4 标准溶液配制 5.4.1 外标标准储备液(2000μg/mL):分别准确称取0.200g(精确至0.0001g)各标准品用一级水溶 解并转移至100mL容量瓶中,定容至刻度,4℃避光保存,保存期为3个月。 5.4.2 13种稳定同位素内标标准储备液(200μg/mL):分别准确称取0.020g(精确至0.0001g)各标 准品用一级水溶解并转移至100mL容量瓶中,定容至刻度。4℃避光保存,保存期为3个月。 5.4.3 外标混合标准中间液(10μg/mL):准确移取125μL各氨基酸外标标准储备液(5.4.1)于25mL 容量瓶,用一级水定容至刻度。4℃避光保存,保存期为3个月。 5.4.4 内标混合标准中间液(10μg/mL):准确移取500μL稳定同位素内标标准储备液(5.4.2)于 10mL容量瓶中,用一级水定容至刻度。临用现配。 5.4.5 外标混合标准工作液(4μg/mL):准确移取4mL外标混合标准中间液(5.4.3)至10mL容量瓶 中,用一级水定容至刻度。临用现配。 5.4.6 内标混合标准工作液(2.5μg/mL):准确移取1.25mL内标混合标准中间液(5.4.4)至5mL容 量瓶中,用一级水定容至刻度。临用现配。 2GB/T46451—2025 6 仪器和设备 6.1 液相色谱-串联三重四极杆质谱仪:配有电喷雾(ESI)离子源。 6.2 分析天平:分度值0.0001g。 6.3 恒温水浴装置。 6.4 离心机:离心力(18000±500)g。 6.5 涡旋混匀器:转速为0r/min~2500r/min。 6.6 超声波清洗仪。 6.7 振荡研磨仪。 6.8 移液器:1.0μL~10.0μL。 7 分析步骤 7.1 试样提取 7.1.1 固体样本 称取约25mg固体样本,分别加入10μL2.5μg/mL内标混合标准工作液、10μL10%磺基水杨酸 和180μL0.1%甲酸水溶液后加入两颗钢珠放入振荡研磨仪研磨3min,加入300μL0.1%甲酸水溶液 涡旋混匀后超声15min,以离心力为(18000±500)g的离心机(6.4)在4℃离心15min,取50μL上 清液,待衍生。 7.1.2 液体样本 准确移取100μL液体样本,使用移液枪(6.7)加入10μL2.5μg/mL内标混合标准工作液,涡旋混 匀,加入10μL10%磺基水杨酸和380μL0.1%甲酸水溶液,涡旋混匀后超声15min,以离心力为 (18000±500)g的离心机(6.4)在4℃离心15min,取50μL上清液,待衍生。 7.2 试剂衍生 精密吸取上述待衍生溶液50μL(7.1)置于1.5mL离心管中,加入衍生试剂FDAA(3mg/mL)溶 液100μL,加入50μL0.05mol/L三乙胺溶液,涡旋混匀,盖紧管盖并采用封口膜密封,置于40℃水浴 锅中反应16h,取出后加入50μL0.1mol/L醋酸溶液,150μL10%乙腈水溶液,涡旋混匀后,以离心力 为(18000±500)g的离心机(6.4)在4℃离心15min,取上清液转移至进样小瓶待测定。 7.3 仪器参考条件 7.3.1 液相条件如下: a) 色谱柱:五氟苯基柱(4.6×250mm,5μm),或相当者; b) 流动相:乙腈和10mmol/L乙酸铵水溶液; c) 流速:0.5mL/min; d) 柱温:35℃±0.5℃; e) 进样量:1μL; f) 洗脱梯度见表1。 3GB/T46451—2025 表1 超高效液相色谱洗脱梯度参考条件 时间 min流速 mL/min流动相A %流动相B % 0.000 0.500 90 10 2.000 0.500 90 10 20.000 0.500 55 45 21.000 0.500 0 100 23.000 0.500 0 100 23.100 0.500 90 10 27.00