书 书 书犐犆犛 １１ ． ２２０ 犆犆犛犆 ３０ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ４１５２２ — ２０２２ 三种犬病病毒基因芯片检测方法 犕犲狋犺狅犱狅犳犇犖犃犿犻犮狉狅犪狉狉犪狔犳狅狉犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳狋犺狉犲犲犮犪狀犻狀犲狏犻狉狌狊犲狊 　 ２０２２  ０７  １１ 发布 ２０２２  ０７  １１ 实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本文件按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２０２０ 《 标准化工作导则 　 第 １ 部分 ： 标准化文件的结构和起草规则 》 的规定起草 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由全国生物芯片标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ４２１ ） 归口 。 本文件起草单位 ： 中国海关科学技术研究中心 、 博奥生物集团有限公司 、 北京农学院 、 上海海关动植物与食品检验检疫技术中心 。 本文件主要起草人 ： 汪琳 、 高志强 、 尹羿 、 赵相鹏 、 任彤 、 蒲静 、 方雪恩 、 张伟 、 赖平安 、 蒋迪 、 刘凤华 、 薛俊欣 、 李健 、 卢先东 、 刘艳红 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ４１５２２ — ２０２２ 三种犬病病毒基因芯片检测方法 １ 　 范围 本文件描述了同时检测三种犬病病毒 （ ＣＤＶ 、 ＣＰＶ 和 ＣＡＶ１ ） 的微阵列基因芯片检测方法和微流控芯片检测方法 。 本文件适用于待测对象鼻拭子 、 粪拭子 、 血浆 、 血清及脏器肌肉组织等样品中三种病毒核酸的同时快速检测 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。 其中 ， 注日期的引用文件 ， 仅该日期对应的版本适用于本文件 ； 不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ＧＢ１９４８９ 　 实验室生物安全通用要求 ＧＢ ／ Ｔ２７４０１ 　 实验室质量控制规范 　 动物检疫 ＧＢ ／ Ｔ４０４５８ — ２０２１ 　 用于病原微生物高通量检测的核酸提取技术规范 ３ 　 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 。 ４ 　 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 ＢＳＡ ： 牛血清白蛋白 （ ＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍＡｌｂｕｍｉｎ ） ＣＡＶ１ ： 犬 １ 型腺病毒 （ Ｃａｎｉｎｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ１ ） ｃＤＮＡ ： 互补 ＤＮＡ （ ＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙＤｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ ） ＣＤＶ ： 犬瘟热病毒 （ ＣａｎｉｎｅＤｉｓｔｅｍｐｅｒｖｉｒｕｓ ） ＣＰＶ ： 犬细小病毒 （ ＣａｎｉｎｅＰａｒｖｏｖｉｒｕｓ ） ＤＥＰＣ ： 焦碳酸二乙酯 （ ＤｉｅｔｈｙｌＰｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ ） ＤＮＡ ： 脱氧核糖核酸 （ ＤｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ ） ｄＮＴＰｓ ： 核苷三磷酸 （ ＮｕｃｌｅｏｓｉｄｅＴｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ） ＤＭＳＯ ： 二甲基亚砜 （ ＤｉｍｅｔｈｙｌＳｕｌｆｏｘｉｄｅ ） ＤＴＴ ： 二硫苏糖醇 （ Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ ） ＥＤＴＡ ： 乙二胺四乙酸 （ ＥｔｈｙｌｅｎｅＤｉａｍｉｎｅＴｅｔｒａａｃｅｔｉｃＡｃｉｄ ） ＰＢＳ ： 磷酸缓冲盐溶液 （ ＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ ） ＰＣＲ ： 聚合酶链式反应 （ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ ） ＲＮＡ ： 核糖核酸 （ ＲｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ ） １ 犌犅 ／ 犜 ４１５２２ — ２０２２ ＲＮａｓｅ ： 核糖核酸酶 （ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ） Ｒｎａｓｉｎ ： 核糖核酸酶抑制剂 （ ＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ ） ＲＴＰＣＲ ： 反转录  聚合酶链反应 （ ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ ） ＳＤＳ ： 十二烷基磺酸钠 （ ＳｏｄｉｕｍＤｏｄｅｃｙｌＳｕｌｆａｔｅ ） ＳＳＣ ： 柠檬酸钠缓冲液 （ ＣｉｔｒｉｃａｃｄＳｏｄｉｕｍＣｉｔｒａｔｅＢｕｆｆｅｒ ） 犜犪狇 酶 ： 犜犪狇 聚合酶 （ ＴｈｅｒｍｕｓＡｑｕａｔｉｃｕｓ ） ＴｒｉｓＨＣＬ ： 三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液 （ ＴＲＩＳＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ ） ５ 　 原理 在序列比对基础上 ， 分别针对 ＣＤＶ 、 ＣＰＶ 和 ＣＡＶ１ 保守区设计合成引物和探针 。 对于三种犬病病毒的微阵列基因芯片检测方法 ， 用点样仪将长度为 ２０ｎｔ 左右的寡核苷酸探针 ， 点制在醛基化玻璃基片上 。 对待检样品进行检测时 ， 先用引物将样品中存在的病毒核酸保守区扩增出来 ， 再通过标记 ＰＣＲ 将荧光染料 Ｃｙ３ 或 Ｃｙ５ 标记在扩增产物上 ， 当扩增产物与芯片杂交后 ， 杂交位点就会发出荧光信号 ， 通过芯片扫描仪捕获荧光信号 ， 从而确定样品中是否含有这三种犬病病毒核酸 。 对于三种犬病病毒的微流控芯片检测方法 ， 将引物分别固定在微流控芯片相应位置后 ， 对微流控芯片进行封装 ， 将提取的核酸模板与反应液 （ 包含荧光物质 ） 混合反应后 ， 加入封装好的微流控芯片中 ， 之后放入带有离心功能 、 恒温功能及实时荧光检测一体化的微流控芯片检测仪中 ， 利用离心力驱动样品进入微流控芯片反应孔 ， 进行恒温扩增 。 若样本中含有目的片段 ， 则能够得到恒温扩增 ， 扩增产物与荧光物质进行有效的结合 ， 通过荧光检测仪实时捕获荧光信号 ， 直观反应扩增产物的产生 ， 根据实时荧光信号的出现时间 、 强度和位置 ， 判断样本中是否含有相应的病毒核酸 。 ６ 　 仪器与材料 ６ ． １ 　 仪器 ６ ． １ ． １ 　 芯片点样仪 。 ６ ． １ ． ２ 　 芯片扫描仪 。 ６ ． １ ． ３ 　 微流控芯片检测仪 。 ６ ． １ ． ４ 　 ＰＣＲ 仪 。 ６ ． １ ． ５ 　 纯水仪 。 ６ ． １ ． ６ 　 芯片杂交盒 。 ６ ． １ ． ７ 　 高速微型离心机 （ 离心速度 １２０００ｒ ／ ｍｉｎ 以上 ）。 ６ ． １ ． ８ 　 台式高速离心机 （ 离心速度 ３０００ｒ ／ ｍｉｎ 以上 ）。 ６ ． １ ． ９ 　 旋涡振荡仪 。 ６ ． １ ． １０ 　 恒温干燥箱 。 ６ ． １ ． １１ 　 旋涡振荡仪 。 ６ ． １ ． １２ 　 微量点样仪 。 ６ ． １ ． １３ 　 低温冰箱 。 ６ ． １ ． １４ 　 微量进样器 （ ０．５ μ Ｌ 、 ２ μ Ｌ 、 １０ μ Ｌ 、 １００ μ Ｌ 、 １０００ μ Ｌ ）。 ６ ． ２ 　 试剂和耗材 ６ ． ２ ． １ 　 总则 ： 除特别说明以外 ， 本文件所用试剂均为分析纯 ， 水为按照 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 规定的三级水 ， 所有试剂均用无 ＲＮａｓｅ 污染的容器分装 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ４１５２２ — ２０２２ ６ ． ２ ． ２ 　 阴性对照 、 阳性对照和微流控芯片内参对照的成分如下 。 ——— 阴性对照 ： 无 ＲＮａｓｅ 水 。 ——— 阳性对照 ： 从阳性样本中提取的核酸 ， 或人工合成的含有目标核酸序列的 ＤＮＡ 片段 。 ——— 内参对照 ： 包括扩增内参基因片段的引物和人工合成的内参质粒 ， 其中引物固定于微流控芯片反应孔中 ， 内参质粒存在于反应液中 。 ６ ． ２ ． ３ 　 ＰＢＳ （ 应符合附录 Ａ 的规定 ）： １２１℃ ， １５ｍｉｎ 高压灭菌冷却后 ， 无菌条件下加入青霉素 、 链霉素各 １００００Ｕ ／ ｍＬ 。 ６ ． ２ ． ４ 　 核酸裂解液 ： １００ｍｍｏｌ ／ ＬＴｒｉｓＨＣＬ ， ５０ｍｍｏｌ ／ ＬＥＤＴＡ ， ０．５％ＳＤＳ ， ５ｍｏｌ ／ Ｌ 盐酸胍 ， ５ｍｏｌ ／ Ｌ 尿素 ， １％ 吐温 ２０ 。 ６ ． ２ ． ５ 　 核酸提取试剂 ： 包含蛋白酶 （ ２０ｍｇ ／ ｍＬ ）、 磁珠 （ ５０ｍｇ ／ ｍＬ ）、 裂解液 、 异丙醇 、 洗液一 、 洗液二 、 洗液三和洗脱液等 。 也可以使用其他等效核酸提取试剂或者将 ＤＮＡ 或 ＲＮＡ 分别提取的试剂 。 ６ ． ２ ． ６ 　 ７５％ 乙醇 ： 用新开启的无水乙醇和 ＤＥＰＣ 水 （ 符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 要求 ） 配制 ， －２０℃ 预冷 。 ６ ． ２ ． ７ 　 微阵列芯片检测缓冲液配制 、 引物 、 探针序列 、 反应液体系 、 杂交液体系组成 、 芯片制作及使用注意事项应符合附录 Ａ 和附录 Ｂ 中表 Ｂ．１ ～ 表 Ｂ．３ 的规定 。 ６ ． ２ ． ８ 　 微流控芯片反应液 ： ２０ｍｍｏｌ ／ ＬＴｒｉｓＨＣｌ （ ｐＨ８．８ ）， １０ｍｍｏｌ ／ ＬＫＣｌ ， １０ｍｍｏｌ ／ Ｌ （ ＮＨ ４ ） ２ ＳＯ ４ ， ８ｍｍｏｌ ／ ＬＭｇＳＯ ４ ， ０．１％ 吐温 ２０ ， １．４ｍｍｏｌ ／ ＬｄＮＴＰｓ ； Ｂｓｔ 酶 ， ８００Ｕ ／ ｍＬ ； ５０ μ ｍｏｌ ／ ＬＳＹＢＲＧｒｅｅｎ 荧光染料 ； 内参质粒 （ ４００ｃｏｐｉｅｓ ／ μ Ｌ ）； 反转录酶 ， ４０Ｕ ／ μ Ｌ ； Ｒｎａｓｉｎ ， ０．８Ｕ ／ μ Ｌ 。 ６ ． ２ ． ９ 　 微流控芯片 ： ５ μ Ｌ ／ 反应池 ， ８ 样本的离心微流控芯片 。 ＣＰＶ 、 ＣＤＶ 和 ＣＡＶ１ 引物应符合附录 Ｃ 中表 Ｃ．２ ～ 表 Ｃ．４ 的规定 。