书 书 书犐犆犛 ６５ ． ０２０ ． ３０ 犆犆犛犅 ４１ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ４１２３４ — ２０２２ 水生动物 犚犖犃 病毒核酸检测参考物质质量控制规范 　 假病毒 犛狆犲犮犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳狇狌犪犾犻狋狔犮狅狀狋狉狅犾狅犳狉犲犳犲狉犲狀犮犲犿犪狋犲狉犻犪犾狊犳狅狉犚犖犃狏犻狉狌狊犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犪狇狌犪狋犻犮犪狀犻犿犪犾狊 — 犃狉犿狅狉犲犱犚犖犃 　 ２０２２  ０３  ０９ 发布 ２０２２  １０  ０１ 实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本文件按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２０２０ 《 标准化工作导则 　 第 １ 部分 ： 标准化文件的结构和起草规则 》 的规定起草 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由中华人民共和国农业农村部提出 。 本文件由全国水产标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ１５６ ） 归口 。 本文件起草单位 ： 中国检验检疫科学研究院 、 连云港海关 、 北京海关 。 本文件主要起草人 ： 张 、 林祥梅 、 王娜 、 吴绍强 、 景宏丽 、 邓俊花 、 周毅 、 谷强 、 任彤 、 江育林 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ４１２３４ — ２０２２ 水生动物 犚犖犃 病毒核酸检测参考物质质量控制规范 　 假病毒 １ 　 范围 本文件给出了作为水生动物 ＲＮＡ 病毒核酸检测参考物质的假病毒 ， 其质量控制规范的术语和定 义 、 缩略语 、 原理 、 试剂或材料 、 仪器设备 ， 规定了假病毒的质量控制 、 假病毒的保存 、 假病毒的验证 ， 以及 假病毒质量评价方法 。 本文件适用于水生动物 ＲＮＡ 病毒核酸检测中假病毒 （ 装甲 ＲＮＡ ） 类参考物质的质量控制 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。 其中 ， 注日期的引用文 件 ， 仅该日期对应的版本适用于本文件 ； 不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于 本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ３ 　 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 ３ ． １ 变异系数 　 犮狅犲犳犳犻犮犻犲狀狋狅犳狏犪狉犻犪狋犻狅狀 概率分布离散程度的一个归一化量度 ， 其定义为数据标准差与数据平均值之比 。 ３ ． ２ 初始样 　 犳狉狅狀狋狊犪犿狆犾犲 按照制备先后顺序 ， 最先制备的 １ ／ ３ 批次产品 。 ３ ． ３ 假病毒 　 犪狉犿狅狉犲犱犚犖犃 外膜蛋白包裹病毒 ＲＮＡ 片段形成的病毒样粒子 。 ３ ． ４ 均匀性 　 狌狀犻犳狅狉犿犻狋狔 同一生产批次的假病毒 ， 每支含有等量目的基因的状态 。 ３ ． ５ 溯源性 　 狋狉犪犮犲犪犫犻犾犻狋狔 假病毒中目的基因序列与病原参考毒株序列的一致性 。 ３ ． ６ 稳定性 　 狊狋犪犫犻犾犻狋狔 假病毒在特定保存条件和保存时间范围内 ， 保证检测结果为阳性的能力 。 １ 犌犅 ／ 犜 ４１２３４ — ２０２２ ３ ． ７ 阳性参考物质 　 狆狅狊犻狋犻狏犲狉犲犳犲狉犲狀犮犲犿犪狋犲狉犻犪犾 与病原拥有某些完全相同的特征 ， 如相同的目的基因序列 、 抗原性 、 敏感性等 ， 用于该病原检测一定会得出理想的阳性检测结果 ， 通常作为阳性对照判定待测样品是否为病原阳性 。 ３ ． ８ 中间样 　 犿犻犱犱犾犲狊犪犿狆犾犲 按照制备先后顺序 ， 中间制备的 １ ／ ３ 批次产品 。 ３ ． ９ 终止样 　 犳犻狀犪犾狊犪犿狆犾犲 按照制备先后顺序 ， 最后制备的 １ ／ ３ 批次产品 。 ３ ． １０ 最小有效取样量 　 犿犻狀犻犿狌犿犲犳犳犲犮狋犻狏犲狊犪犿狆犾犲狏狅犾狌犿犲 使用病原检测方法 ， 可检测出阳性结果的最小阳性参考物质的量 。 ４ 　 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 Ａｍｐ ： 氨苄青霉素 （ ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ ） Ｃｔ ： 扩增循环数 （ ｃｙｃｌｅｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ） ｃＤＮＡ ： 互补脱氧核糖核酸 （ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ ） ＤＥＰＣ ： 焦碳酸二乙酯 （ ｄｉｅｔｈｙｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ ） ＤＮＡ ： 脱氧核糖核酸 （ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ ） ｄＡＴＰ ： 三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸 （ ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ） ｄＣＴＰ ： 三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸 （ ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ） ｄＧＴＰ ： 三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸 （ ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ） ｄＮＴＰ ： 脱氧核糖核苷三磷酸 （ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ） ｄＴＴＰ ： 三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸 （ ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ） ＥＢ ： 溴化乙锭 （ ｅｔｈｉｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ ） ＩＰＴＧ ： 异丙基硫代  β Ｄ 半乳糖苷 （ ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β Ｄ１ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ ） ＬＢ ： 营养肉汤 （ ｌｕｒｉａｂｅｒｔａｎｉｂｒｏｔｈ ） ＰＣＲ ： 聚合酶链式反应 （ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ ） ＲＮＡ ： 核糖核酸 （ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ ） ＲＴＰＣＲ ： 逆转录聚合酶链式反应 （ ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ ） ＲＴｑＰＣＲ ： 逆转录实时荧光定量聚合酶链式反应 （ ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌｔｉｍｅｐｏｌ ｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ ） 犜犪狇 ： 水生嗜热菌 （ 犜犺犲狉犿狌狊犪狇狌犪狋犻犮狌狊 ） Ｘｇａｌ ： ５ 溴 ４ 氯 ３ 吲哚  β Ｄ 半乳糖苷 （ ５ｂｒｏｍｏ４ｃｈｌｏｒｏ３ｉｎｄｏｌｙｌ β Ｄｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ ） ５ 　 原理 假病毒为一种病毒样粒子 ， 外膜蛋白为 ＭＳ２ 噬菌体蛋白 ， 包裹用于检测病毒的目的 ＲＮＡ 片段 。 假病毒与 ＭＳ２ 噬菌体类似 ， 能够耐受核酸酶的降解 ， 具有较好的稳定性 ， 且不具备自我复制能力和感染能力 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ４１２３４ — ２０２２ 假病毒表达载体含有 ＭＳ２ 噬菌体的成熟蛋白编码基因 、 衣壳蛋白编码基因和衣壳蛋白编码基因下游影响噬菌体包装的 １９ｂｐ 发夹结构 （ 见附录 Ａ ）； 在多克隆位点中插入病毒目的 ｃＤＮＡ 片段后形成重组假病毒表达载体 ； 该载体在蛋白表达系统中能够将插入的外源片段转录成 ＲＮＡ ， 同时合成的 ＭＳ２ 噬菌体蛋白能够选择性包裹 ＲＮＡ ， 自组装成病毒样粒子 ， 成为假病毒 。 目前假病毒的制备方法主要为 ： 先利用酶切连接法制备表达载体 ， 再利用原核或真核表达系统组装假病毒粒子 ， 制备流程按照附录 Ｂ 进行 。 作为 ＲＮＡ 病毒检测参考物质的假病毒 ， 应具备以下特征 ： 包含有病毒 ＲＮＡ ， 可利用 ＲＴＰＣＲ 、 ＲＴ ｑＰＣＲ 等核酸检测方法特异性检测到病毒 ＲＮＡ ； 具有良好的核酸酶耐受性 ， 保护病毒目的 ＲＮＡ 不被核酸酶降解 ； 不含有病毒 ｃＤＮＡ 。 ６ 　 试剂或材料 ６ ． １ 　 本文件中所有化学试剂 ， 除特别注明外 ， 全部为分析纯试剂 。 ６ ． ２ 　 水 ： 符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 中一级水规定 。 ６ ． ３ 　 ＤＥＰＣ 水 ： 商品化试剂 。 ６ ． ４ 　 ＲＴＰＣＲ 试剂和 ＲＴｑＰＣＲ 试剂 ： 商品化试剂 。 ６ ． ５ 　 病毒目的 ＤＮＡ 的扩增引物 ： 可参照相应的国家标准 、 行业标准合成 。 ６ ． ６ 　 Ｔｒｉｚｏｌ ： 商品化试剂 。 ６ ． ７ 　 ＲＮａｓｅ ： 商品化试剂 。 ６ ． ８ 　 ＲＮａｓｅ 灭活处理的 ＥＰ 管 、 试管 、 ＰＣＲ 管 、 移液器枪头 ： 商品化耗材 。 ６ ． ９ 　 假病毒载体 ： 由商品化载体构建 。 ６ ． １０ 　 制备假病毒所需的其他试剂 ： 按照附录 Ｃ 配制 。 ７ 　 仪器设备 ７ ． １ 　 超净工作台 。 ７ ． ２ 　 冷冻高速离心机 。 ７ ． ３ 　 电子天平 。 ７ ． ４ 　 高压灭菌锅 。 ７ ． ５ 　 ＰＣＲ 仪 。 ７ ． ６ 　 电泳仪 。 ７ ． ７ 　 荧光定量 ＰＣＲ 仪 。 ７ ． ８ 　 紫外分光光度计 。 ７ ． ９ 　 凝胶成像系统 。 ７ ． １０ 　 移液器 。 ８ 　 假病毒的质量控制 ８ ． １ 　 假病毒中病毒目的 犚犖犃 片段的检测和溯源性 ８ ． １ ． １ 　 病毒目的 犚犖犃 片段的 犚犜犘犆犚 检测 以所制备的假病毒溶液作为待测样品 ， 定性检测样品中是否含有病毒目的 ＲＮＡ 片段 。 ａ ） 　 提取假病毒的 ＲＮＡ 。 ｂ ） 　 以 ＲＮＡ 为模板 ， 使用相应病毒检测方法推荐的引物和实验条件进行 ＲＴＰＣＲ 扩增 。 设置以 ３ 犌犅 ／ 犜 ４１２３４ — ２０２２ 水为模板的阴性对照 ， 以病毒 ＲＮＡ 为模板的阳性对照 。 ｃ ） 　 反应产物进行电泳观察 。 ８ ． １ ． ２ 　 扩增产物的溯源性分析 将 ８．１．１ 的扩增产物回收 、 测序 。 测序