书 书 书犐犆犛 ０７ ． ０８０ 犃 ２１ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ４０１８３ — ２０２１ 犇犖犃 甲基化的测定 　 焦磷酸测序法 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犇犖犃犿犲狋犺狔犾犪狋犻狅狀 — 犘狔狉狅狊犲狇狌犲狀犮犻狀犵 ２０２１  ０５  ２１ 发布 ２０２１  １２  ０１ 实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 本标准由中国标准化研究院提出并归口 。 本标准起草单位 ： 河北医科大学 、 中国标准化研究院 、 河北省食品检验研究院 、 中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心 、 河北师范大学 。 本标准主要起草人 ： 吕品 、 马爱进 、 张岩 、 林浩 、 李永鹏 、 李东明 、 黄芸 、 杨宏超 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ４０１８３ — ２０２１ 犇犖犃 甲基化的测定 　 焦磷酸测序法 １ 　 范围 本标准规定了用焦磷酸测序法测定 ＤＮＡ 甲基化的方法 。 本标准适用于动植物组织或体外培养细胞 ＤＮＡ 甲基化测定 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ３ 　 术语和定义 、 缩略语 ３ ． １ 　 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 ３ ． １ ． １ 犇犖犃 甲基化 　 犇犖犃犿犲狋犺狔犾犪狋犻狅狀 在 ＤＮＡ 甲基转移酶的催化下 ， 以 Ｓ 腺苷甲硫氨酸为甲基供体 ， 将甲基转移至碱基特定结构上的过程 。 ３ ． ２ 　 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 ＤＮＡ ： 脱氧核糖核酸 （ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ ） ＰＣＲ ： 聚合酶链式反应 （ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ ） ４ 　 原理 ＤＮＡ 经重硫酸盐硫化处理后 ， ＤＮＡ 双链中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶 ， 通过 ＰＣＲ 将尿嘧啶转化为胸腺嘧啶 ， 根据 ＰＣＲ 产物中相应甲基化位点的胞嘧啶和胸腺嘧啶的比例进行定量 。 ５ 　 试剂或材料 除非另有规定 ， 仅使用分析纯试剂 。 ５ ． １ 　 水 ： ＧＢ ／ Ｔ６６８２ ， 二级水 。 ５ ． ２ 　 动物基因组 ＤＮＡ 提取试剂盒 。 ５ ． ３ 　 植物基因组 ＤＮＡ 提取试剂盒 。 ５ ． ４ 　 ２０ｐｍｏｌ ／ μ Ｌ 焦磷酸测序用引物 。 ５ ． ５ 　 ＰＣＲ 试剂盒 。 １ 犌犅 ／ 犜 ４０１８３ — ２０２１ ５ ． ６ 　 ＤＮＡ 重亚硫酸盐快速转化试剂盒 。 ５ ． ７ 　 焦磷酸测序试剂盒 。 ５ ． ８ 　 ７０％ （ 体积分数 ） 乙醇 。 取 ７０ｍＬ 无水乙醇加水稀释定容至 １００ｍＬ 。 ５ ． ９ 　 溴化乙锭溶液 。 称取 １ｇ 溴化乙锭加水稀释定容至 １００ｍＬ ， 磁力搅拌至完全溶解 ， 然后将溶液保存于棕色瓶中 ， 室温保存 。 ５ ． １０ 　 ５０× 电泳缓冲液 。 称取 ２４２ｇＴｒｉｓ 溶于 ８００ｍＬ 蒸馏水中 ， 加入 ５７．１ｍＬ 冰乙酸和 １００ｍＬ０．５ｍｏｌ ／ Ｌ 乙二胺四乙酸溶液 （ ｐＨ８．０ ）， 再加蒸馏水定容至 １０００ｍＬ ， 室温保存 ， 稀释 ５０ 倍使用 。 ５ ． １１ 　 ２％ （ 质量分数 ） 琼脂糖凝胶 。 称取 ２ｇ 琼脂糖置于烧瓶中 ， 加入 １００ｍＬ 电泳缓冲液 ， 加热使琼脂糖充分溶解 ， 适当冷却 ， 然后加入 ７ μ Ｌ 溴化乙锭溶液 ， 混匀 ， 将其缓慢地倒入放有梳子的制胶槽中 ， 室温放置待琼脂糖凝固后拔下梳子 ， 取出凝胶 ， ４℃ 密封保存备用 。 ５ ． １２ 　 ６× 电泳加样缓冲液 。 称取 ０．２５ｇ 溴酚蓝 、 ４０ｇ 蔗糖置于 １００ｍＬ 烧杯中 ， 加蒸馏水至完全溶解后定容至 １００ｍＬ 。 ５ ． １３ 　 ０．５ｍｏｌ ／ Ｌ 乙二胺四乙酸溶液 。 称取 １８．６１ｇ 乙二胺四乙酸二钠二水合物 ， 加入 ８０ｍＬ 水 ， 充分搅拌 ， 用氢氧化钠调 ｐＨ 至 ８．０ ， 然后定容至 １００ｍＬ 。 ５ ． １４ 　 标准相对分子质量 ＤＮＡ （ １００ｂｐ ～ ２０００ｂｐ ）。 ６ 　 仪器设备 ６ ． １ 　 分析天平 ： 感量 ０．００１ｇ 。 ６ ． ２ 　 离心管 ： １．５ｍＬ 和 ２ｍＬ 。 ６ ． ３ 　 ＰＣＲ 仪 。 ６ ． ４ 　 水平电泳槽 。 ６ ． ５ 　 电泳仪 。 ６ ． ６ 　 低温离心机 ： 最大离心力 ２５９１０ 犵 。 ６ ． ７ 　 凝胶成像系统 。 ６ ． ８ 　 核酸检测仪 。 ６ ． ９ 　 焦磷酸测序仪 。 ６ ． １０ 　 ＰＣＲ 管 。 ７ 　 测定步骤 ７ ． １ 　 犇犖犃 提取 按照动物或植物基因组 ＤＮＡ 提取试剂盒说明进行提取 。 ７ ． ２ 　 犇犖犃 重亚硫酸盐转化 按照 ＤＮＡ 重亚硫酸盐快速转化试剂盒说明进行操作 。 ７ ． ３ 　 甲基化 犘犆犚 扩增目的片段 ７ ． ３ ． １ 　 犘犆犚 反应体系 配制 ５０ μ ＬＰＣＲ 反应体系 ： 以 １０ｎｇ ～ ２０ｎｇ 重亚硫酸盐转化后的 ＤＮＡ 溶液为模板 ， 按照 ＰＣＲ 试剂盒说明加入试剂 ， 再加入焦磷酸测序引物对中的上下游引物各 ０．５ μ Ｌ ， 用水补足体积至 ５０ μ Ｌ 。 在 ＰＣＲ 仪上扩增 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ４０１８３ — ２０２１ ７ ． ３ ． ２ 　 犘犆犚 扩增产物电泳检测 在电泳槽中加入电泳缓冲液 ， 使液面刚刚没过琼脂糖凝胶 ； 将 ３ μ Ｌ ～ ６ μ ＬＰＣＲ 扩增产物分别和适量 ６× 电泳加样缓冲液混合 ， 点样 ； 以标准相对分子质量 ＤＮＡ 做对照 ； ９Ｖ ／ ｃｍ 恒压电泳 ， 直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部 ； 用凝胶成像系统观察电泳结果并记录 ； 电泳检测合格的 ＰＣＲ 产物用于测序 。 ７ ． ４ 　 焦磷酸测序 利用焦磷酸测序仪及焦磷酸测序试剂盒进行以下操作 ： 在焦磷酸测序仪配套软件中生成运行程序 ， 加载运行前试剂耗材和程序 ， 将上样圆盘放入机器 ， 按程序在相应的孔位加入 １０ μ Ｌ 含生物素标记的 ＰＣＲ 产物和 ３ μ Ｌ 焦磷酸测序测序仪配套的磁珠 ， 运行焦磷酸测序仪程序 ， 导出结果 。 ８ 　 结果分析 使用焦磷酸测序仪将运行后的数据拷贝到电脑中 ， 打开软件并载入运行后的文件 ， 选择 ＣｐＧ 模式 ， 对每个样本的焦磷酸测序结果进行分析 ， 结果中所测位点处显示的百分数即为该位点甲基化的比例 。 犌犅 ／ 犜 ４０１８３ — ２０２１