ICS11.080 C50 中华人民共和国国家标准 GB/T33417—2016 过氧化氢气体灭菌生物指示物检验方法 Testmethodofbiologicalindicatorforhydrogenperoxidevapour sterilizationprocesses 2016-12-30发布 2017-07-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会提出并归口。 本标准起草单位:中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所、中国人民解放军疾病预防控 制所、中国医学科学院协和医院。 本标准主要起草人:张流波、张剑、姚楚水、张青、王立飞、张玮、王香、王洪敏、史绍毅、王妍彦、邱侠、 马玲、朱亭亭。 ⅠGB/T33417—2016 过氧化氢气体灭菌生物指示物检验方法 1 范围 本标准规定了过氧化氢气体灭菌生物指示物的检验方法。 本标准适用于过氧化氢气体灭菌生物指示物的检验。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB18281.1 医疗保健产品灭菌 生物指示物 第1部分:通则 GB/T24628 医疗保健产品灭菌 生物与化学指示物 测试设备 消毒技术规范(2002年版) 卫生部 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 生物指示物 biologicalindicator;BI 对指定条件下的特定灭菌程序具有一定抗力,并装在内层包装中可供使用的染菌载体。 3.2 过氧化氢气体灭菌 hydrogenperoxidevapoursterilization 以汽化的过氧化氢作为主要杀灭微生物因子的灭菌方式。 3.3 载体 carrier 试验微生物的支持物。 3.4 存活时间 survivaltime;ST 测定生物指示物抗力时,受试样本经杀菌因子作用后,全部有菌生长的最长作用时间。 3.5 杀灭时间 killingtime;KT 测定生物指示物抗力时,受试样本经杀菌因子作用后,全部无菌生长的最短作用时间。 3.6 D值 Dvalue 杀灭微生物数量达到90%所需要的时间。 3.7 自含式生物指示物 self-containedbiologicalindicator 含有微生物复苏生长所需培养基的生物指示物。 1GB/T33417—2016 3.8 生物指示物抗力测试仪 biologicalindicatorevaluatorresistometer 产生限定条件下灭菌过程中物理变化规定组合,以测量抗力的专用设备。 4 检验指标与方法 4.1 抗力 4.1.1 菌种 用于制作过氧化氢气体灭菌生物指示物的菌株为嗜热脂肪杆菌芽孢(Geobacillusstearothermophilus ATCC7953或SSIK31)或被证明具有本标准所要求的同等性能的微生物。 4.1.2 菌量 回收菌量大于或等于1×106CFU/片,对于成品的指示物,载体回收的菌量与说明书上的菌量误差 在-50%~+300%之间。测定菌量时,应最少测试4个样本,具体检测方法参见附录A。 4.1.3 D值 测试时应使用生物指示物抗力测试仪,生物指示物抗力测试仪要求见GB/T24628。在使用浓度 为59%±2%过氧化氢,灭菌舱内作用浓度为2.3mg/L±0.4mg/L,作用温度50℃±0.5℃的条件下, D值的要求为0.75s~8s。对于成品的生物指示物,测试的D值应在说明书上的D值±20%范围内。 应使用下列2种方法进行测试: a) 部分阴性法测试D值,参见附录B; b) 验证法测试D值,将a)测试出的D值和4.1.2的回收菌量的平均数带入式(1)和式(2),计算 出ST值和KT值。参见附录C。 ST≥(logN0-2)×D值 …………………………(1) KT≤(logN0+4)×D值 …………………………(2) 式中: N0———每批生物指示物的回收菌量的平均数。 4.2 载体 按GB18281.1的要求进行灭菌过程兼容性的测试。 4.3 恢复培养基 4.3.1 恢复培养基应满足下列要求: a) 有使10CFU~100CFU的微生物恢复生长的能力; b) 有使损伤的微生物恢复生长的能力,并且有中和残留的灭菌因子对微生物抑制生长的能力; c) 经过过氧化氢气体灭菌后不会产生抑制微生物生长的物质。 4.3.2 恢复培养基按以下方法检验: 每个样本的恢复培养基中,接种10CFU~100CFU的嗜热脂肪杆菌芽孢(ATCC7953),同时设置 阴性对照和阳性对照,培养至规定时间后观察有无嗜热脂肪杆菌芽孢生长(一般观察培养基的颜色变 化)。如果恢复培养基有菌生长,并且阴性对照无菌生长和阳性对照有菌生长,判断恢复培养液合格。 2GB/T33417—2016 4.4 稳定性试验 取包装完好的同批次生物指示物放置于制造商建议的保存条件下,存放至标签和说明书规定的有 效期限,取出再次进行评价,生物指示物应符合4.1、4.2和4.3的要求。 3GB/T33417—2016 附 录 A (资料性附录) 活菌培养计数方法 A.1 取含有10mLTPS(0.1%胰蛋白胨的生理盐水溶液)的无菌试管,加入适量无菌玻璃珠,将计数菌 片投入试管,用电动混合器混合,到菌片被完全打碎,制成菌悬液。 A.2 将试管按需要数量分组排列于试管架上,每管加入4.5mLTPS。各组由左向右,逐管标上10-1、 10-2、10-3……等。 A.3 将菌悬液样本用电动混匀器混合20s,或在手掌上用力振打80次,随即吸取0.5mL加至10-1 管内。 A.4 将10-1管依前法用电动混匀器混合20s,或在手掌上用力振打80次,混匀,再吸取出0.5mL加 入10-2管内。如此类推,直至最后一管。必要时,还可作某稀释度的1∶1或1∶4稀释。 A.5 选择适宜稀释度试管(以预计生长菌落数每平板为15CFU~300CFU者为宜),吸取其中混合均 匀的悬液1.0mL加于无菌平皿内。每一稀释度接种2个平皿。一般需接种2个~3个不同稀释度。 A.6 将熔化的40℃~45℃嗜热脂肪杆菌芽孢恢复培养基,见《消毒技术规范(2002年版)》,倾注于已 加入样液的平皿中,每平皿15mL~20mL。 A.7 将平皿盖好,即刻轻轻摇动混匀,平放。待琼脂凝固后,翻转平皿使底向上,置56℃±2℃恒温培 养箱内培养。 A.8 培养至72h,计数菌落数。一般以肉眼观察,必要时用放大镜检查。以每平板菌落数在30CFU~ 300CFU的稀释度为准记录结果。 A.9 根据稀释倍数和接种量计算每毫升菌液中或每一菌片(染菌载体)上的平均菌落数。 4GB/T33417—2016 附 录 B (资料性附录) 部分阴性法计算D值 B.1 随机选取120个样本。分成6组,每组20个样本。 B.2 生物指示物抗力测试仪设置如下: a) 暴露温度:50℃±0.5℃; b) 暴露剂量:2.3mg/L±0.4mg/L; c) 暴露时间至少为6个时间点,至少1个时间点全部有菌生长,至少2个时间点部分有菌生长, 至少2个时间点全部无菌生长。 B.3 对6组样本分别暴露。 B.4 暴露完成后将6组生物指示物在56℃±2℃温度下,按照说明书要求培养到规定时间,记录阴性 和阳性结果。当最短暴露时间点全部为阳性,最长的2个暴露时间全部为阴性,并且中间至少2组有部 分样本阳性,试验结果有效,带入式(B.1)和式(B.2)计算D值。 B.5 部分阴性法(LimitedSpearman-Karber法)D值的计算见式(B.1)、式(B.2): UHSK=UK-d 2-d n∑i=6 i=1ri …………………………(B.1) D=UHSK log10N0+0.2507…………………………(B.2) 式中: UHSK———达到无菌生长平均时间,单位为秒(s); UK———首次显示所有样本无菌生长的暴露时间,单位为秒(s); d———暴露时间的固定间隔,单位为秒(s); n———每组的样本量,单位为个; ri———每次暴露无菌样本数量,单位为个; N0———回收菌落数,单位为CFU。 5GB/T33417—2016 附 录 C (资料性附录) 验证法测试D值 C.1 ST值验证 将50个试验样本放入过氧化氢气体生物指示物抗力测试仪中,作用浓度为2.3mg/L±0.4mg/L, 在50℃±0.5℃时,暴露时间设定为计算出的ST值,暴露完成后,将50个生物指示物样本取出,置于 56℃±2℃培养至说明书规定时间。若全部有菌生长,则计算的ST值通过验证;若有样本无菌生长, 则计算的ST值没有通过验证。 C.2 KT值验证 将50个试验样本放入过氧化氢气体生物指示物抗力测试仪中,作用浓度为2.3mg/L±0.4mg/L, 在50℃±0.5℃时,暴露时间设定为计算出的KT值,暴露完成后,将50个生物指示物样本取出,置于 56℃±2℃培养至说明书规定时间。若全部无菌生长,则计算的KT值通过验证;若有样本有菌生长, 则计算的KT值没有通过验证。 C.3 判定 计算的ST值和KT值都通过验证,则判定测出的D值有效。 6GB/T33417—2016