ICS71.040.50 G80 中华人民共和国国家标准 GB/T33249—2016 纳 米技术 活细胞内金纳米棒含量测定 消光光谱法 Nanotechnology—Quantificationofgoldnanorodsinlivingcells— Extinctionspectroscopy 2016-12-13发布 2017-07-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布目 次 前言 Ⅰ ………………………………………………………………………………………………………… 引言 Ⅱ ………………………………………………………………………………………………………… 1 范围 1 ……………………………………………………………………………………………………… 2 规范性引用文件 1 ………………………………………………………………………………………… 3 术语和定义 1 ……………………………………………………………………………………………… 4 基本原理 1 ………………………………………………………………………………………………… 5 仪器设备 2 ………………………………………………………………………………………………… 6 制备 2 ……………………………………………………………………………………………………… 7 测量方法 3 ………………………………………………………………………………………………… 8 细胞内金纳米棒的计算 3 ………………………………………………………………………………… 9 不确定度来源 4 …………………………………………………………………………………………… 10 测量结果 4 ………………………………………………………………………………………………… 附录A(资料性附录) 金纳米棒制备实例 5 ……………………………………………………………… 附录B(资料性附录) 活细胞内金纳米棒定量测定实例 6 ……………………………………………… 附录C(资料性附录) 不确定度评定示例 8 ……………………………………………………………… 附录D(资料性附录) 用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)对消光光谱法进行验证 9 ………………… 附录E(资料性附录) 消光光谱法测定活细胞内金纳米棒含量的测试报告格式 10 …………………… 参考文献 11 ……………………………………………………………………………………………………GB/T33249—2016 前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中国科学院提出。 本标准由全国纳米技术标准化技术委员会(SAC/TC279)归口。 本标准起草单位:中国医学科学院基础医学研究所、国家纳米科学中心。 本标准主要起草人:许海燕、吴晓春、张卫奇、纪英露、温涛。 ⅠGB/T33249—2016 引 言 金纳米棒是由金原子构成的棒状纳米结构。由于具有独特的物理化学性质,金纳米棒应用于生物 医学检测、生物医学成像、肿瘤光热治疗和药物递送等方面。当金纳米棒应用于上述生物医学领域时, 细胞内金纳米棒的含量是一个十分关键的指标,可以定量地反映其进入细胞的效率,对于新型纳米载体 和造影剂的设计具有参考价值。 本方法基于金纳米棒的消光特性,应用消光光谱法快速测定金纳米棒在活细胞内的含量,同时还可 以获得金纳米棒在细胞内的聚集状态信息。 ⅡGB/T33249—2016 纳米技术 活细胞内金纳米棒含量测定 消光光谱法 1 范围 本标准规定了采用紫外/可见/近红外消光光谱法测定活细胞内金纳米棒含量的方法。 本标准适用于定量测量活细胞内金纳米棒结构的含量,定量测量活细胞内其他棒状贵金属纳米结 构的含量亦可参照本标准执行。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T24369.1—2009 金纳米棒表征 第1部分:紫外/可见/近红外吸收光谱方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 消光光谱 extinctionspectrum 待测物质浓度和消光池厚度不变时,消光度(或消光度的任意函数)对应波长(或波长的任意函数) 的曲线。 注:修改GB/T9721—2006,定义3.2。 3.2 表面等离激元共振 surfaceplasmonresonance;SPR 当入射电磁波照射到金属表面上时,金属中的自由电子在电场的驱动下相对于正离子的晶格以一 定的频率发生相干振荡。 [GB/T24369.1—2009,定义3.2] 3.3 金纳米棒 goldnanorods(AuNRs) 由金元素构成的纳米尺度的棒状颗粒,其在一个维度上的尺度与其他两个维度之比均大于1。在 尺度较小的两个维度上的尺寸应介于1nm~100nm之间。 4 基本原理 金纳米棒表面等离激元共振具有两个特征消光带,根据紫外/可见/近红外吸收光谱方法(见 GB/T24369.1—2009)得到金纳米棒的消光光谱图,见图1a),其中横向等离激元共振峰(1)在480nm~ 600nm之间,其峰面积与金纳米棒的浓度正相关;纵向表面等离激元共振峰(2)位于近红外光谱区,其 峰位由金纳米棒的轴比、形状和外部介电环境决定。体外活细胞的磷酸盐缓冲液(PBS)悬液对峰1无 1GB/T33249—2016 影响[图1b)曲线a],计算时作为背景曲线扣除后,就获得了细胞内金纳米棒的消光光谱。PBS和聚集 状态基本上都不影响峰1。通过计算扣除背景后的横向表面等离激元共振峰面积得到细胞中的金纳米 棒含量。 a) 金纳米棒水溶胶的消光光谱 b) 人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)摄取金纳米棒 前(曲线a)、后(曲线b)的消光光谱 说明: 实线———曲线a; 虚线———曲线b; 1———横向等离激元共振峰; 2———纵向等离激元共振峰。 图1 金纳米棒的消光光谱 5 仪器设备 具有测量消光光谱测量功能的酶标仪,波长扫描范围:400nm~999nm。使用前对酶标仪进行 校准。 6 制备 6.1 金纳米棒的制备 金纳米棒的制备实例参见附录A。 6.2 PBS缓冲液 称取8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4,加超纯水定容至1000mL。所用试 剂均为分析纯。 6.3 细胞悬液 与金纳米棒孵育后,贴壁细胞用常规胰酶消化,非贴壁细胞直接室温离心,弃上清液。收获的细胞 加入适量PBS缓冲液洗涤3遍,用于细胞计数和后续的测定。 2GB/T33249—2016 7 测量方法 7.1 细胞计数 利用细胞计数板计数不少于3次,取平均值。 7.2 测量步骤 7.2.1 在酶标仪上设定波长范围、吸光度范围、扫描速度等测量参数。 7.2.2 向酶标板中加入与金纳米棒共同孵育后的细胞悬液200μL,未经金纳米棒处理的细胞悬液作为 对照。扫描后扣除对照光谱,得到细胞中金纳米棒的光谱。 7.2.3 平行样品数不少于3个。 8 细胞内金纳米棒的计算 8.1 峰面积计算方法 计算图2中阴影部分(峰1)的面积。参照附录B。 说明: 1———横向等离激元共振峰; 2———纵向等离激元共振峰。 图2 峰面积的计算 8.2 细胞中金纳米棒含量模拟标准曲线的建立 8.2.1 将未经金纳米棒处理的活细胞悬液计数,室温离心,弃上清液,加入超纯水,按常规方法制备细 胞裂解液。 8.2.2 将呈梯度浓度的金纳米棒溶胶分散于8.2.1的细胞裂解液中,测试体积为200μL,得到消光光 谱;扣除细胞裂解液的背景光谱。参见8.1的方法计算峰面积,做标准曲线,见图3。 3GB/T33249—2016 图3 峰1面积与裂解液中金纳米棒浓度的标准曲线 8.3 细胞内金纳米棒含量的计算 根据标准曲线,计算出金纳米棒的含量,除以细胞总数,获得单细胞中金纳米棒的含量。 9 不确定度来源 样品测试结果的标准不确定度来源包括但不仅限于:由测量平均值时重复性引起的不确定度、浓度 校准、仪器校准、标准曲线的不确定度分量组成。不确定度评定参见附录C。 10 测量结果 10.1 活细胞内金纳米棒定量测定实例参见附录B。 10.2 用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)对消光光谱法进行验证参见附录D。 10.3 消光光谱法测定活细胞内金纳米棒含量的测试报告格式参见附录E。 4GB/T33249—2016