ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T33127—2016 甘蔗线条病毒检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofSugarcanestreakvirus 2016-10-13发布 2017-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国海南出入境检验检 疫局。 本标准主要起草人:冯黎霞、武目涛、刘福秀、赵立荣、王卫芳、杨雷亮。 ⅠGB/T33127—2016 甘蔗线条病毒检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了甘蔗线条病毒的检疫鉴定方法。 本标准适用于可能带有甘蔗线条病毒的活体寄主植物的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 SN/T1840 植物病毒免疫电镜检测方法 SN/T2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 3 甘蔗线条病毒基本信息 中文名:甘蔗线条病毒。 学名:Sugarcanestreakvirus。 缩写:SSV。 分类地位:双生病毒科(Geminiviridae),玉米线条病毒属(Mastrevirus)。 甘蔗线条病毒的其他信息参见附录A。 4 方法原理 SSV的免疫原性和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据。利用常规PCR、实时荧光PCR、双抗体 夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)和免疫电镜方法对样品进行检测。 5 仪器设备、设施、用具和试剂 5.1 仪器 电子天平(感量0.001g)、高速离心机、小型瞬时离心机、超低温冰箱(-80℃)、制冰机、涡旋振荡 器、磁力搅拌器、高压灭菌锅、pH计、透射电子显微镜、超净工作台、PCR仪、实时荧光定量PCR仪、微 波炉、电泳仪、电泳槽、凝胶成像分析仪、酶联检测仪。 5.2 设施 隔离温室(10℃~30℃)。 5.3 用具 酶联板、可调移液器(2.5μL、10μL、20μL、100μL、1000μL)和可调移液器头、离心管、研钵、微型 1GB/T33127—2016 磨杵等。 5.4 试剂 除有特别说明外,所有试剂均为分析纯,实验用水应符合GB/T6682中相关规定。DAS-ELISA测 定试剂见附录B;PCR检测试剂见附录C;实时荧光PCR检测试剂见附录D。 6 症状观察与抽样 6.1 症状观察 现场检疫主要观察植物材料上病毒为害的症状,SSV为害症状描述参见附录A。 6.2 抽样 发现有病毒为害症状的植物材料直接送检;未发现症状的,则按SN/T2122中规定进行抽样,并送 实验室检测鉴定。 7 实验室检测 7.1 双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA) 对待检组织进行研磨,并按1∶10(质量∶体积)的比例加入抽提缓冲液,制备的汁液分别盛装于离 心管中,离心后吸取上清液作为待测样品,并设阳性对照、阴性对照和空白对照。具体操作步骤见附 录B。 7.2 常规PCR检测 植株叶片液氮研细,取0.1g用于提取植物总DNA,双蒸水作为空白对照。分别提取样品和对照的 DNA后进行常规PCR检测,具体操作步骤见附录C。 7.3 实时荧光PCR检测 实时荧光PCR检测的阴性和阳性对照设置同7.1,双蒸水作为空白对照。分别提取样品和对照的 DNA后进行实时荧光PCR检测,具体操作见附录D。 7.4 免疫电镜检测 按照SN/T1840中规定的方法制备样品和进行电镜观察病毒粒子形态。在免疫电镜下如观察到 大小为30nm×20nm的杆状双联体粒体,即可判定结果阳性。 8 结果判定 样品检测时,检测结果判定按下述原则进行: ———样品经PCR检测为阴性;或者样品经PCR检测为阳性,但是序列测定结果与目的序列不一 致,则判定样品不携带甘蔗线条病毒。 ———样品经PCR检测为阳性,且序列测定结果为目的序列;同时免疫电镜、DAS-ELISA、荧光PCR 这三种检测方法其中一种为阳性检测结果,即可判定样品携带甘蔗线条病毒。 2GB/T33127—2016 9 样品与记录结果保存 经检验确定携带甘蔗线条病毒的样品应保存在适合的条件下以备复核。实验样品保存在-20℃ 冰箱中,有条件的保存在-80℃冰箱中更好。做好登记和标记工作。 记录包括样品来源、种类、取样人员、实验的时间、地点、方法和结果、检验检疫员的签字等。双抗付 夹心酶联免疫吸附测定法检测应有酶联板反应的数值,PCR检测应有电泳结果照片。 3GB/T33127—2016 附 录 A (资料性附录) 甘蔗线条病毒背景资料 A.1 寄主范围 甘蔗(Saccharumofficinarum)、蒺藜草(Cenchrusechinatus)、两耳草(Paspalumconjugatum)、柔 毛狗尾草(Setariabarbata)、弯叶画眉草(Eragrostiscurvula)。 A.2 分布 印度、巴基斯坦、尼日利亚、贝宁、多哥、塞内加尔、科特迪瓦、肯尼亚、马拉维、毛里求斯、莫桑比克、 南非、苏丹、乌干达等许多国家和地区。 A.3 病害症状 SSV影响寄主植物的整个生长期,可以导致对该病毒敏感品种11%以上的损失。受感染植株叶片 有无数小的斑点或条纹,病斑透明状,细窄,与叶脉平行。侵染后期,条斑不规则分布,植株下部叶片症 状严重,植株生长受阻。病毒主要分布在叶肉细胞、茎尖分生细胞及韧皮细胞中。 A.4 传播途径 SSV可通过种茎和苗木等无性繁殖材料远距离传播。可以通过多种叶蝉(Cicadulinaspp.)以持 久性方式传播,在昆虫介体体内不能增殖,不能经过机械、嫁接、种子、花粉和植株间相互接触进行传播。 A.5 粒体形态 病毒粒体为双联体结构,大小30nm×20nm。 A.6 基因组 基因组为单链环状DNA,长2760nt左右,病毒正义链有两个阅读开放框(ORF),分别编码运动 蛋白和外壳蛋白;互补链编码2个ORF,经mRNA剪接合成复制酶蛋白。 4GB/T33127—2016 附 录 B (规范性附录) 双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA) B.1 主要试剂 B.1.1 包被抗体 特异性的甘蔗线条病毒抗体。 B.1.2 酶标抗体 碱性磷酸酯酶标记的甘蔗线条病毒抗体。 B.1.3 样品抽提缓冲液(pH7.4) 亚硫酸钠(Na2SO3) 1.3g 聚乙烯基吡咯烷酮(PVP,MW24000~40000)20g 叠氮钠(NaN3) 0.2g 吐温-20 20mL 溶于900mL的1×PBST中,用HCl调节pH至7.4,定容至1000mL。 B.1.4 10×PBST缓冲液(pH7.4) 氯化钠(NaCl) 80g 磷酸二氢钾(KH2PO4) 2g 磷酸氢二钠(Na2HPO4) 11.5g 氯化钾(KCl) 2g 吐温-20 5mL 溶于900mL的蒸馏水中,用浓盐酸(HCl)调节pH至7.4,并定容至1000mL。 B.1.5 包被抗体缓冲液(pH9.6) 碳酸钠(Na2CO3) 1.59g 碳酸氢钠(NaHCO3) 2.93g 溶于900mL蒸馏水中,用浓盐酸(HCl)调节pH至9.6,并定容至1000mL。 B.1.6 酶标抗体缓冲液(pH7.4) 1×PBST缓冲液 800mL 牛血清白蛋白(BSA) 2g PVP(MW24000~40000) 20g 用无菌蒸馏水定容至1000mL。 B.1.7 底物(pNPP)缓冲液(pH9.8) 二乙醇胺(C4H11NO2) 97mL 5GB/T33127—2016 叠氮钠(NaN3) 0.2g 溶于600mL的无菌蒸馏水中,用浓盐酸(HCl)调节pH至9.8,然后用蒸馏水定容至1000mL。 B.1.8 反应终止液 氢氧化钠(NaOH)120g溶于1000mL的无菌蒸馏水中,浓度3mol/L。 B.2 实验步骤 B.2.1 包被抗体 用包被缓冲液将包被抗体按说明稀释,加入酶联板孔中,100μL/孔,加盖,37℃孵育2h,清空孔中 溶液,PBST洗涤4次,每次3min。 B.2.2 样品制备 待测样品幼嫩叶片按1∶10(质量∶体积)加入抽提缓冲液,用研钵研磨成浆,2000g离心10min, 上清液即为制备好的检测样品。对阴性对照、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行。 B.2.3 加样 加入制备好的检测样品、阴性对照、阳性对照,100μL/孔,加盖,37℃孵育2h或4℃冰箱孵育过 夜,PBST洗涤4次,每次3min。 B.2.4 加酶标抗体 根据说明书用酶标抗体稀释缓冲液将酶标抗体稀释至工作浓度,加入到酶联板中,100μL/孔,加 盖,37℃孵育2h,PBST洗涤4次,每次3min。 B.2.5 加底物 将底物pNPP加入底物缓冲液中,终浓度为1mg/mL(现配现用),每孔加入100μL,室温避光孵育 30min。必要时每孔加入50μL3mol/L氢氧化钠溶液终止反应。 B.2.6 读数 30min后用酶标仪在405nm处读OD值。 B.3 结果判定 B.3.1 对照孔的OD405值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔),应该在质量控制范围内,即: 缓冲液孔和阴性对照孔的OD405值均<0.15,当阴性对照孔的OD405值<0.05时,按0.05计算;阳性 对照OD405值/阴性对照OD405值>5