ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T33122—2016 花园葱蜗牛检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofCepaeahortensis(Müller,1774) 2016-10-13发布 2017-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中国湿地博物馆、浙江自然博物馆。 本标准主要起草人:周卫川、王沛、李敏、杨海芳、沈建国、于文涛、钱周兴、虞赟、林阳武。 ⅠGB/T33122—2016 花园葱蜗牛检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了花园葱蜗牛Cepaeahortensis(Müller,1774)的检疫鉴定方法。 本标准适用于花园葱蜗牛的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 SN/T3067 软体动物常规检疫规范 3 术语和定义 SN/T3067界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 生殖器 genitalia 蜗牛的交配和繁殖器官。 注:雄性生殖器主要包括输精管、阴茎、阴茎本体、阴茎牵引肌、鞭状体等部分,雌性生殖器主要包括矢囊、副矢囊、 恋矢、黏液腺、受精囊、受精囊柄、盲管等部分。 3.2 鞭状体 flagellum 蜗牛雄性生殖系统中的附器,由阴茎本体末端分支形成。 3.3 盲管 diverticulum 由受精囊柄分支形成的管状结构。 注:盲管为大蜗牛科Helicidae的基本特征。 3.4 矢囊 dartsack 蜗牛雌性生殖系统中一个藏有1枚或多枚骨针的肌肉质的囊状结构。 3.5 恋矢 Lovedart 矢囊中钙质或壳质的骨针,为蜗牛交配时刺激器官。 注:恋矢的质地和形状常用于分类。 3.6 壳口 aperture 贝壳开口部位,为蜗牛头和腹足的出口。 注:壳口的边缘为口唇,按其在壳口中的位置不同可分为内唇、外唇、轴唇、基唇、上唇和下唇。 1GB/T33122—2016 4 基本信息 学名:Cepaeahortensis(Müller,1774)。 异名:HelixhortensisMüller,1774。 英文名:White-lippedbandedsnail,White-lippedgrovesnail,White-lippedgardensnail。 分类地位:软体动物门Mollusca,腹足纲Gastropoda,柄眼目Stylommatophora,大蜗牛科 Helicidae,葱蜗牛属CepaeaHeld,1837。花园葱蜗牛的近似种有森林葱蜗牛C.nemoralis(Linnaeus, 1758)、维也纳葱蜗牛C.vindobonensis(Pfeiffer,1828)。 5 方法原理 花园葱蜗牛昼伏夜出,常隐藏在人们难以发现的地方,易于传播。其传播特点是不需要特定的寄 主,凡接触过地面的物品都可能传播。传播方式和传播途径是确定现场检疫方式的依据。贝壳形态、软 体解剖和分子特征是实验室鉴定的主要依据。 6 器具与试剂 6.1 器具 体视显微镜、放大镜、手电筒、塑料自封袋、广口标本瓶、4mm孔径土壤筛、小铁铲、游标卡尺、搪瓷 盘、培养皿、解剖针(直径0.15mm)、镊子、剪刀、小剪刀、显微镊子、显微剪刀、解剖腊盘、标签、移液枪、 微型离心机、PCR仪、1.5mL离心管、0.2mLPCR反应管、恒温金属浴。 6.2 试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯。 75%乙醇、无水乙醇、硫酸镁、动物基因组DNA提取试剂盒、PCR反应液、ddH2O。 7 现场检测 对来自疫区(参见附录A)的运输工具和货物实施重点查验。仔细检查运输工具、木质包装物、未经 加工的植物性材料、苗木、花卉、盆景、废塑料等是否有蜗牛附着其上,花园葱蜗牛昼伏夜出,尤其要注意 阴暗蔽光处的检查,用手电筒仔细寻找蜗牛的行迹。蜗牛爬行过后,会留下银灰色的丝带状黏液痕迹, 这是判定是否有蜗牛污染的重要依据。发现蜗牛,随时装入塑料自封袋或标本瓶,带回实验室做进一步 的检验鉴定。发现盆景等携带土壤或其他细碎衬垫材料时,需过筛检查是否有卵或幼螺。 8 实验室鉴定 8.1 测量观察和软体解剖 用游标卡尺测量蜗牛贝壳的壳高和壳宽、卵粒长和宽。用肉眼或放大镜或体视显微镜仔细观察卵 和螺的形态特征。 将闷杀(见10.1)处理后的标本,参照SN/T3067解剖软体,分离出生殖系统。 2GB/T33122—2016 8.2 葱蜗牛属CepaeaHeld,1837鉴定特征 贝壳无脐孔,圆球形或稍压扁,一般具有5条黑褐色的色带,但也有完全无色带的个体。有5个螺 层,最后一个螺层向下倾斜。壳口倾斜,口缘宽大且内增厚,下缘直。颚片粗壮,具有4条~6条粗肋, 齿舌的中央齿和侧齿无齿尖。恋矢有时具有4条裂脊,黏液腺具有一显著长的分支。受精囊柄很长,分 支形成盲管,阴茎具有长的鞭状体。 8.3 花园葱蜗牛Cepaeahortensis(Müller,1774)鉴定特征 8.3.1 卵 卵圆形,白色,短径2mm,长径2.5mm。 8.3.2 贝壳 8.3.2.1 成螺 贝壳扁球形,缓慢膨胀,有5个~51 2个螺层,脐孔完全被唇缘覆盖。壳口“U”形,口唇白色粗短,偶 而有褐色,外唇向外延伸反折,内唇贴覆于体螺层上,形成一薄的白色胼胝部。贝壳色彩明亮,有光泽, 其上有微弱而不规则的生长嵴和螺旋状的色带0条~5条,故也称白唇彩带蜗牛。贝壳在颜色和色带 数量方面变异很大。极少数口唇是褐色的个体,在形态上很像森林葱蜗牛Cepaeanemoralis (Linnaeus,1758),但本种贝壳更细薄一些,螺层更圆滑一些,尺度更小一些。壳高10mm~15mm,壳 宽14mm~20mm。参见附录B中图B.1:A、B、C。 8.3.2.2 幼螺 幼螺贝壳在外部形态上与成螺无多大差异,只是个体小,壳质薄,口缘外唇不向外延伸扩展。 8.3.3 螺体 腹足肌肉发达,通常呈灰绿色,头部棕色,从触角基部中央到颈部之间有一条浅色的线条。蜗牛爬 行时其软体伸展长度可达3.5cm~4.2cm。参见图B.1:D。 8.3.4 生殖系统 阴茎长,阴茎本体与阴茎差不多等长,阴茎本体略带紫色。鞭状体细长。阴茎牵引肌薄而宽,中等 长度。受精囊柄长,略粗。矢囊大,椭圆形,无副矢囊。黏液腺两枝,分别长在阴道两侧,每枝二分叉,分 叉后每枝又分2枝~3枝,即一枝黏液腺有4个~6个分支,而森林葱蜗牛最多只有3个分支;黏液腺管 状,粗实且长,光滑。阴道呈明显的紫色。参见图B.2。 8.3.5 COI基因序列鉴定 按附录C方法提取DNA、PCR扩增和双向测序,将所测序列与已知花园葱蜗牛的COI基因序列 (Genbank登录号为KF596879.2)进行比对,相似度一般应≥96%。参见附录C。 9 结果评定 以贝壳形态为基本鉴定依据,螺体和外生殖器解剖形态为辅助鉴定特征,并注意与近似种鉴别(参 见附录D),对于口唇为白色的个体,符合8.3.2或同时符合8.3.2、8.3.3、8.3.4形态特征的蜗牛鉴定为花 3GB/T33122—2016 园葱蜗牛Cepaeahortensis(Müller,1774);对于口唇为褐色的个体,应同时符合8.3.2、8.3.3、8.3.4形 态特征的蜗牛才鉴定为花园葱蜗牛C.hortensis(Müller,1774)。单独查获的卵粒符合8.3.1形态特 征,应通过孵化和饲养实验(参见SN/T3067),做进一步的鉴定。符合8.3.5作为前期初筛或最终鉴定 结果的分子佐证。 10 标本处理和保存 10.1 标本处理 将蜗牛置于盛满水的瓶中,盖上瓶盖,进行闷杀,蜗牛在慢慢窒息的死亡过程中,逐渐伸展身体;或 逐渐加入少量硫酸镁,进行麻醉闷杀。 将闷杀后伸展的蜗牛标本置于无水乙醇中浸泡1d~2d,然后在75%乙醇溶液中固定,每隔1d~ 2d换1次乙醇溶液,共换3次~4次,便可长期保存于75%乙醇溶液中。解剖后的生殖系统可直接保 存于75%乙醇溶液中。 10.2 标本保存 经处理后的标本,至少妥善保存6个月,并注明时间、产地、寄主、采集人等信息。 4GB/T33122—2016 附 录 A (资料性附录) 花园葱蜗牛寄主、地理分布及其他信息 A.1 寄主植物 杂食性。幼螺以腐殖质、植物的幼苗和嫩芽为食;成螺取食各种绿色植物的茎和叶。 A.2 地理分布 欧洲:中欧、西欧、北欧、冰岛地区。具体分布的国家包括英国、德国、法国、荷兰、卢森堡、比利时、波 兰、瑞典、挪威、芬兰、冰岛、拉脱维亚、爱沙尼亚、乌克兰(西部)、俄罗斯(加里宁格勒)、白俄罗斯(维帖布 斯克)。 北美洲:美国(东部)、加拿大。 A.3 生物学习性与危害性 花园葱蜗牛Cepaeahortensis(Müller,1774)是我国颁布的进境植物检疫性有害生物。该螺昼伏 夜出,常藏匿于阴暗处,可以休眠方式随货物和木质包装材料远距离传播。花园葱蜗牛为农业生产上的 重要有害生物,不但可直接危害各种蔬菜、瓜果、花卉和农作物,而且也是许多人畜共患寄生虫的中间宿 主,影响人畜健康。如在西欧的黑醋栗收获期间,这种蜗牛平时歇息在灌木丛中,这时会爬到果盆、果箱 中歇息,不但给田间生产造成直接危害,而且经常在运输过程中严重污染果品,导致工厂拒绝收货,造成