ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T33120—2016 梨疱状溃疡类病毒检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofPearblistercankerviroid 2016-10-13发布 2017-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国湖北出入境检验检疫局、中华人民共和国中山出入境检验检疫 局、中华人民共和国新疆出入境检验检疫局、中华人民共和国云南出入境检验检疫局、中华人民共和国 山东出入境检验检疫局、中华人民共和国检验检疫科学研究院、华中农业大学植物科技学院。 本标准主要起草人:王振华、陈定虎、叶芸、徐文兴、徐家文、曾宪东、徐雪、张永江、王翀、李旻、王英超、 吴兴海。 ⅠGB/T33120—2016 梨疱状溃疡类病毒检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了梨疱状溃疡类病毒的检疫鉴定方法。 本标准适用于进出境梨树种苗、组培苗及植株中梨疱状溃疡类病毒的检疫和鉴定。 2 梨疱状溃疡类病毒基本信息 学名:Pearblistercankerviroid。 缩写:PBCVd。 异名:梨泡斑类病毒。 分类地位:马铃薯纺锤块茎类病毒科(Pospiviroidae),苹果锈皮类病毒属(Apscaviroid)。 传播途径:通过嫁接、芽接和刀具机械传播,但没有有关介体及种子传毒的报道。远距离通过种苗 调运传播。 梨疱状溃疡类病毒的其他信息参见附录A。 3 方法原理 根据梨疱状溃疡类病毒全长RNA核酸链中的保守区域设计了一对扩增该类病毒全长核酸的引 物,进行RT-PCR扩增和序列测定;根据梨疱状溃疡类病毒全长核酸序列设计与正单链RNA互补的单 链RNA探针,通过杂交信号强弱进行结果判定。 4 仪器设备和主要试剂 4.1 仪器设备 超净工作台、灭菌锅、制冰机、高速冷冻离心机、超低温冰箱、常规冰箱、涡旋振荡器、微量进样器、垂 直电泳槽、PCR仪、凝胶成像系统、杂交炉、交联仪、杂交管、化学发光检测仪等。 4.2 主要试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯。RT-PCR试剂见附录B;分子杂交试剂见附录C。 5 症状观察 取样品量1%~5%(若样品少可适量增大比例)的种苗进行检查。检查梨疱状溃疡类病毒侵染症 状,树皮上形成疱状物或树皮开裂、溃疡、鳞状表皮或表皮深裂,树势衰退。 1GB/T33120—2016 6 实验室鉴定 6.1 RT-PCR检测 RT-PCR检测见附录B。 6.2 分子杂交检测 分子杂交检测见附录C。 7 结果判定 在每次检测中阴性对照和空白对照均表现为阴性,而阳性对照表现为阳性,则说明检测体系可靠, 在此条件下,如果样品经RT-PCR和分子杂交两种检测方法均为阳性反应,并经测序验证,则可判定样 品中带有梨疱状溃疡类病毒;如果RT-PCR检测和杂交检测结果均为阴性,则可确定样品不带有梨疱 状溃疡类病毒。 8 样品保存 8.1 样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出梨疱状溃疡类病毒的样品应嫁接在砧木上,温室大 棚种植隔离保存,同时-70℃超低温保存,以备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。 8.2 结果记录与资料保存 完整的实验记录包括:样品的来源、种类、时间,实验的时间、地点、方法、RT-PCR检测结果图片、核 苷酸测定序列、分子杂交检测结果图片等,并要有实验人员和审核人员签字。 2GB/T33120—2016 附 录 A (资料性附录) 梨疱状溃疡类病毒其他信息 A.1 地理分布 法国、西班牙、意大利、日本、希腊、突尼斯、马耳他、阿根廷、中国(湖北和新疆)。 A.2 寄主范围 目前报道的寄主范围限于蔷薇科(Rosaceae)的梨属(Pyrus)、苹果属(Malus)和山楂属 (Crataegus)植物。梨属种包括杜梨(P.betulifolia)、豆梨(P.calleryana)、西洋梨(P.communis)、沙 梨(P.serotina)雪梨(P.nivalis)等;苹果和山楂属的个别种如山丁子(M.baccata)、八棱海棠(M.robusta) 和山楂(C.monogyna)等。 A.3 基因组特征 梨疱状溃疡类病毒为一共价闭合环状的单链RNA分子,长约314个碱基。 序列(NCBI登陆号:NC_001830)如下: CUUUCCUGAGGUUCCUGUGGUGCUCCCCUGACCUGCGUUCCAAAAAGCGAAAAAGUGAGAGGCCCU AGGGGCUUCUCGGCUCGUCGUCGACGAAGGGUCUAGAAGCCUGGGCGCUGGCUGGAGCGCGCGGCU GUGAGUAAUCGCUCCUUUGGAGAAGAAAACCAGCGUUGCUUCCUGCCUGAGCCUCGUCUUCUG UCCCGCUAGUCGAGCGGACAACCCGAGCACCGCCGAAGCGCUUUUUUCUUUUAUAGCAGCUUGG CUUCGCGGCGAGGGUGGAAGUUUACCGCGGACCCCCGAGAGGAGGCCCUCGGGUCC A.4 症状 梨疱状溃疡类病毒能潜伏侵染很多西洋梨(P.communis)商业品种,叶片及果实不表现任何病理 症状。在一些敏感品种上仅在树皮上表现症状,侵染的第二年在树皮上形成疱状物或树皮开裂,并逐步 转变为溃疡、鳞状表皮或表皮深裂,进而树势衰退,导致梨树得病后5年~8年死亡。图A.1为该病毒 在不同梨品种枝干上的溃疡症状。 注:引自http://www-intranet.angers.inra.fr/dossiers/virus/fichvir3.html。 图A.1 梨疱状溃疡类病毒在不同梨品种枝干上的溃疡症状 3GB/T33120—2016 附 录 B (规范性附录) RT-PCR检测方法 B.1 试剂 B.1.1 核酸提取和RT-PCR相关试剂 DEPC处理超纯水:取制备好的去离子水500mL,加入500μLDEPC摇床振荡过夜,高温高压灭 菌后室温保存。 1mol/LTris-HCl(pH8.0):称取12.11gTris,加50mLDEPC处理超纯水溶解,用浓HCl调pH值 至8.0,定容至100mL,高温高压灭菌后室温保存。 0.5mol/LEDTA(pH8.0):称取18.61gNa2EDTA·2H2O,加80mL处理超纯水溶解,用约2g NaOH调pH值至8.0,加DEPC100μL,定容至100mL,摇床振荡过夜,高温高压灭菌后室温保存。 10×TE(pH8.0):取1mol/LTris-HCl(pH8.0)10mL和0.5mol/LEDTA(pH8.0)2mL,加 50mLDEPC处理超纯水溶解,定容至100mL,高温高压灭菌后室温保存。 10×STE溶液:取1mol/LTris-HCl(pH8.0)10mL、5mol/LNaCl20mL和0.5mol/LEDTA (pH8.0)2mL,加50mLDEPC处理超纯水溶解,调pH值至6.8,定容至100mL,高温高压灭菌后室 温保存。 10%SDS:称取10gSDS,加80mL超纯水溶解,定容至100mL后室温保存。 3mol/L乙酸钠(pH5.2)溶液:称取40.8gNaAc·3H2O,加40mL超纯水溶解,用冰乙酸调pH 值至5.2,定容至100mL,加40μLDEPC摇床振荡过夜,高温高压灭菌后室温保存。 酚∶三氯甲烷∶异戊醇(25∶24∶1):取饱和酚25mL、三氯甲烷24mL、异戊醇1mL,充分混匀 后,用TE(pH8.0)覆盖,棕色瓶中保存。 三氯甲烷∶异戊醇(24∶1):取三氯甲烷48mL、异戊醇2mL,充分混匀后,TE(pH8.0)覆盖,棕色 瓶中保存。 反转录酶M-MLV、dNTPs、RNA酶抑制剂(Rnasin)、TaqDNA聚合酶和CF-11纤维素。 B.1.2 PAGE凝胶电泳的相关试剂 30%丙烯酰胺:在70mL蒸馏水中加入29g丙烯酰胺(acrylamide,Acr)和1gN,N'-亚甲基双丙 烯酰胺(N,N'-methylene-bis-acrylamide,Bis),加热溶解后,定容至100mL,置棕色瓶中室温保存。 10%过硫酰铵:称取0.5g过硫酰铵溶于5mL蒸馏水中,4℃保存。 5×TBE贮备液:称取54gTris,27.5g硼酸,加20mL0.5mol/LEDTA(pH8.0),溶解于适量蒸 馏水,最后用蒸馏水定容至1L,室温保存。 50×TAE:称取242gTris,溶解于适量蒸馏水,加入57.1mL冰乙酸,100mL500mmol/LEDTA (pH8.0),最后用蒸馏水定容至1L,室温保存。 B.2 引物 正向引物:5'-GTCTGAAGCCTGGGCGCTGG-3' 反向引物:5'-CCTTCGTCGACGACGAGCCGAG-3' 目标扩增产物长度为314bp左右。 4GB/T33120—2016 B.3 核酸提取 称取0.10g叶片,液氮研磨,转入离心管;立即加入600μL1×STE,80μL10%SDS,400μL水饱 和酚,400μL三氯甲烷,涡旋10min,12000r/min离心8min;取上清液于新的离心管中,加无水乙醇 至终浓度为30%,加10mg纤维素粉,涡旋10min,5000r/min离心3min