ICS65.080 G20 中华人民共和国国家标准 GB/T32951—2016 有机肥料中土霉素、四环素、金霉素与强力 霉素的含量测定 高效液相色谱法 Determinationofoxytetracyline,tetracyline,chlortetracyclineanddoxycycline contentfororganicfertilizers—HPLCmethod 2016-08-29发布 2017-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中国石油和化学工业联合会提出。 本标准由全国肥料和土壤调理剂标准化技术委员会(SAC/TC105)归口。 本标准起草单位:上海化工研究院、上海出入境检验检疫局工业品与原材料检测技术中心、泰州市 产品质量监督检验所、上海交通大学。 本标准主要起草人:周辉、周韵、孙明星、商照聪、叶平、马明、闵红、沈国清、赵杰、洪丽玲。 ⅠGB/T32951—2016 有机肥料中土霉素、四环素、金霉素与强力 霉素的含量测定 高效液相色谱法 警告:使用本标准可能会涉及到危险的材料、操作和设备,但本标准无意对与其使用相关的所有安 全问题都提出建议。使用者在应用本标准之前,有责任建立使用的安全和防护措施,并确定相关规章限 制的使用性。 1 范围 本标准规定了有机肥料中土霉素、四环素、金霉素和强力霉素含量的高效液相色谱检测方法。 本标准适用于有机肥料、有机-无机复混肥料中土霉素、四环素、金霉素和强力霉素含量的测定。 本标准不适用于豆饼肥中土霉素、四环素、金霉素和强力霉素含量的测定。 本方法检出限分别为:土霉素0.75mg/kg,四环素0.75mg/kg,金霉素1.0mg/kg,强力霉 素0.75mg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6379.1 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第1部分:总则与定义 GB/T6379.2 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第2部分:确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 试样中土霉素、四环素、金霉素和强力霉素经Na2EDTA-Mcllvaine-甲醇提取液提取、固相萃取小柱 净化处理后进样,高效液相色谱紫外检测器测定,外标法定量。 4 试剂和材料 除另有说明外,所有试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。 4.1 甲醇:色谱纯。 4.2 乙腈:色谱纯。 4.3 磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)。 4.4 柠檬酸(C6H8O7·H2O)。 4.5 乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA·2H2O)。 4.6 水合草酸(C2H2O4·2H2O)。 4.7 磷酸氢二钠溶液:0.4mol/L。称取143.26g磷酸氢二钠,用水溶解,定容至1000mL。 4.8 柠檬酸溶液:0.2mol/L。称取42.03g柠檬酸,用水溶解,定容至1000mL。 1GB/T32951—2016 4.9 乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)溶液:0.1mol/L。称取37.22g乙二胺四乙酸二钠,用水溶解,定 容至1000mL。 4.10 磷酸氢二钠-柠檬酸(Mcllvaine)缓冲液(pH=6.8±0.05):将1000mL0.4mol/L磷酸氢二钠溶 液(见4.7)与294mL0.2mol/L柠檬酸溶液(见4.8)混合。 4.11 Na2EDTA-Mcllvaine-甲醇提取液:取Na2EDTA(见4.9),磷酸氢二钠-柠檬酸(Mcllvaine)缓冲液 (见4.10)与甲醇按1+1+2(体积)比例混匀,必要时用NaOH溶液或HCl溶液调节pH=7.20±0.05。 4.12 草酸溶液:0.01mol/L。称取1.26g草酸,用水溶解,定容至1000mL。 4.13 甲醇-水(1+19):量取5mL甲醇与95mL水混匀。 4.14 草酸-甲醇溶液:0.01mol/L。称取0.13g草酸,用甲醇溶解,定容至100mL。 4.15 土霉素(oxytetracycline,CAS:2058-46-0)、四环素(tetracyline,CAS:64-75-5)、金霉素(chlortet- racycline,CAS:64-72-2)、强力霉素(doxycycline,CAS:24390-14-5)标准物质:纯度92%~98%。 4.16 土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准储备溶液:2mg/mL。准确称取一定量的土霉素、四环素、 金霉素、强力霉素标准物质(见4.15),分别用甲醇配成2mg/mL的标准储备液。储备液于0℃~8℃ 保存。 4.17 土霉素、四环素、金霉素、强力霉素混合标准溶液:分别取5mL土霉素、四环素、金霉素、强力霉 素标准储备液(见4.16)至100mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,混匀,每种物质浓度为100μg/mL,储 存于冰箱中,每周配制。 4.18 固相萃取柱(二乙烯基苯和N-乙烯基吡咯烷酮的大孔共聚物-HLB或相当者):300mg/3mL。 使用前依次通过2mL甲醇及2mL水预处理,保持柱体湿润。 5 仪器和设备 5.1 液相色谱仪:配紫外检测器。 5.2 分析天平:感量0.1mg。 5.3 机械振荡提取仪:50次/min~500次/min。 5.4 冷冻离心机:转速大于3500r/min。 5.5 固相萃取装置。 5.6 真空泵。 5.7 氮气吹干仪。 5.8 pH计:测量精度±0.02。 5.9 针式过滤头:0.22μm。 5.10 金属试验筛:0.5mm。 6 试样制备与保存 6.1 试样的制备 将样品粉粹,全部通过0.5mm试验筛,待用。 6.2 试样保存 过筛的实验室样品在室温(约25℃)下避光保存,并注意防潮防霉。 2GB/T32951—2016 7 分析步骤 7.1 称样 称取过筛的试样1.0g~2.0g,精确至0.1mg。 7.2 提取 试料置于50mL带盖塑料离心管中。向试料中加入20mLNa2EDTA-Mcllvaine-甲醇提取液,于 机械振荡提取仪中室温(约25℃)下提取20min,于15℃下置于离心机上,离心速度不小于 3500r/min,离心10min,取上清液至另一离心管中。残渣中再依次加入20mL、10mLNa2EDTA- Mcllvaine-甲醇提取液,重复提取两次,合并上清液并定容至50mL。 7.3 净化 从定容的50mL上清液中取5mL置于氮气吹干仪上,室温(约25℃)下吹至原体积的一半左右, 加适量水稀释至体积约5mL,以1mL/min的速度通过已活化处理的固相萃取柱。依次用5mL水, 5mL甲醇-水淋洗固相萃取柱,弃去全部流出液。减压抽干5min,用5mL草酸-甲醇溶液洗脱目标物。 洗脱液使用饱和NaOH溶液调至pH约为5~6,置于氮气吹干仪上吹至近干,用1mL水溶解残渣,过 0.22μm滤膜,按7.4.3.1测定一进行测定。 当有机肥样品中基体及杂质对目标物色谱峰没有影响时,可省略7.3净化步骤,试样经7.2提取步 骤后,过0.22μm滤膜按照7.4.3.2测定二进行测定。 7.4 测定 7.4.1 液相色谱参考条件 推荐的液相色谱条件如下: a) 色谱柱:C18柱,2.7μm,4.6mm×100mm或相当者; b)流动相及梯度洗脱条件:见表1; c)流速:1.0mL/min; d)柱温:30℃; e)检测波长:355nm; f)进样量:20μL。 表1 流动相及梯度洗脱条件 时间/min 流动相[乙腈(4.2)]/% 流动相[0.01mol/L草酸(4.12)]/% 流动相[甲醇(4.1)]/% 8 8 84 8 10 15 70 15 16 15 70 15 17 8 84 8 25 8 84 8 3GB/T32951—2016 7.4.2 工作曲线 7.4.2.1 曲线一 分别从土霉素、四环素、金霉素、强力霉素混合标准溶液(见4.17)中取0.1mL、0.2mL、0.4mL、 1.0mL、2.0mL、4.0mL置于6个100mL容量瓶中,用Na2EDTA-Mcllvaine-甲醇提取液稀释至刻度 得到系列溶液,分别取5mL置于氮气吹干仪上,室温(约25℃)下吹至原体积的一半左右,以下按照7. 3净化步骤处理,最终得到系列混合标准溶液浓度为:0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、 10μg/mL、20μg/mL。 7.4.2.2 曲线二 分别从土霉素、四环素、金霉素、强力霉素混合标准溶液(见4.17)中取0.1mL、1.0mL、2.0mL、 5.0mL、10.0mL、20.0mL置于6个100mL容量瓶中,用Na2EDTA-Mcllvaine-甲醇提取液稀释至刻 度,该系列混合标准溶液浓度为:0.1μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL。 7.4.3 测定 7.4.3.1 测定一 试料经7.2、7.3提取并净化后,待上机测定。按照7.4.2.1曲线一配制系列混合标准溶液,以浓度和 响应峰面积值为x轴、y轴绘制工作曲线,外标法进行定量。测试液中土霉素、四环素、金霉素、强力霉 素的响应值均应在仪器测定的线性范围内,否则应重新调整浓度后测定。 土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质液相色谱图参见附录A中的图A.1。 注