ICS67.200.10 X14 中华人民共和国国家标准 GB/T31579—2015 粮油检验 芝麻油中芝麻素和芝麻林素的 测定 高效液相色谱法 Inspectionofgrainandoils—Determinationofsesaminandsesamolininsesameoil— Highperformanceliquidchromatography 2015-05-15发布 2015-11-28实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家粮食局提出。 本标准由全国粮油标准化技术委员会(SAC/TC270)归口。 本标准负责起草单位:上海市粮食科学研究所。 本标准参加起草单位:上海三添食品有限公司、中国食品药品检定研究院食品化妆品检定所、中国 标准化研究院食品与农业标准化研究所、安徽华安食品有限公司、东莞顶志食品有限公司、安徽国家农 业标准化与监测中心。 本标准主要起草人:曹文明、薛斌、陈凤香、曹进、丁宏、李坤威、何俊、徐彦辉、郭海英、袁超。 ⅠGB/T31579—2015 粮油检验 芝麻油中芝麻素和芝麻林素的 测定 高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了高效液相色谱法测定芝麻油中的芝麻素和芝麻林素的术语和定义、原理、试剂和耗 材、仪器设备、试样的制备、分析步骤、结果计算以及精密度。 本标准适用于芝麻香油、芝麻原油和成品芝麻油中芝麻素和芝麻林素的测定。 本标准方法的检出限为:芝麻素0.01mg/g;芝麻林素0.02mg/g。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6379.1—2004 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第1部分:总则与定义 GB/T6379.2—2004 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第2部分:确定标准测量方 法重复性与再现性的基本方法 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682—2008/ISO3696:1987,MOD) GB/T15687 动植物油脂 试样的制备(GB/T15687—2008/ISO661:2003,IDT) 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 芝麻素 sesamin 又称芝麻脂素,芝麻主要的天然木脂素(木酚素)类物质之一,CAS编号,607-80-7;分子式,C20H18O6; 分子量,354.35。分子结构参见附录A。 3.2 芝麻林素 sesamolin 又称芝麻酚林,芝麻主要的天然木脂素(木酚素)类物质之一,CAS编号,526-07-8;分子式,C20H18O7; 分子量,370.35。分子结构参见附录A。 4 原理 样品中的芝麻素和芝麻林素采用固相萃取技术,提取、净化和富集后,用高效液相色谱仪进行测定, 紫外检测器外标定量。 5 试剂和耗材 5.1 甲醇:色谱纯。 1GB/T31579—2015 5.2 三氯甲烷。 5.3 丙酮。 5.4 环己烷。 5.5 正己烷。 5.6 异丙醇。 5.7 SPE上样液:正己烷+三氯甲烷=70+30,取30mL的三氯甲烷(5.2),加入70mL的正己烷(5.5) 中混匀,现用现配。 5.8 SPE淋洗液:环己烷+丙酮=90+10,取10mL的丙酮(5.3),加入90mL的环己烷(5.4)中混匀, 现用现配。 5.9 SPE洗脱液:环己烷+丙酮=80+20,取20mL的丙酮(5.3),加入80mL的环己烷(5.4)中混匀, 现用现配。 5.10 流动相:甲醇+水=75+25。取250mL的水,加入750mL的甲醇(5.1)中混匀,通过0.45μm的 滤膜(6.4)过滤并脱气。 5.11 标准物质:芝麻素,纯度≥98%;芝麻林素,纯度≥98%。 5.12 标准储备液:精确称量20mg的芝麻素(5.11)标准物质,加入适量的甲醇(5.1),搅拌至完全溶解 后转移至100mL棕色容量瓶中,再用甲醇(5.1)定容,配制成浓度为200mg/L的芝麻素标准储备液, 冷藏保存。采用同样的方法,精确称量20mg的芝麻林素(5.11)标准物质,配制成浓度为200mg/L的 芝麻林素标准储备液,冷藏保存。 5.13 标准工作液:分别准确移取芝麻素和芝麻林素的标准储备液(5.12)各0.2mL、0.4mL、1mL、 2mL和5mL,分别用甲醇(5.1)稀释定容至10mL,得到一系列浓度不同的芝麻素和芝麻林素的混合 标准工作溶液(芝麻素和芝麻林素浓度均分别为4mg/L、8mg/L、20mg/L、40mg/L和100mg/L)。 5.14 25mL棕色容量瓶。 5.15 15mL平口试管。 5.16 5mL、10mL一次性塑料注射器。 5.17 硅胶固相萃取柱,规格:1g/6mL,非键合硅胶固定相,粒径40μm~60μm及其配套转接头。 5.18 氨基固相萃取柱,规格:500mg/3mL,氨丙基键合硅胶固定相,粒径40μm~60μm及其配套转 接头。 5.19 以上所用试剂,除特殊注明外均为分析纯试剂,水为符合GB/T6682规定的一级水。 6 仪器设备 6.1 分析天平:感量0.0001g。 6.2 高效液相色谱仪:配备紫外检测器。 6.3 碟形过滤器:尼龙,有机相,直径13mm,孔径0.45μm。 6.4 滤膜:孔径0.45μm,直径45mm的尼龙膜或相当者。 6.5 微量进样器:20μL。 6.6 氮气吹干仪:选配。 7 试样的制备 按GB/T15687规定的方法制备试样。 2GB/T31579—2015 8 分析步骤 8.1 样品的提取、净化和富集 8.1.1 固相萃取柱的活化 取硅胶固相萃取柱(5.17)和氨基固相萃取柱(5.18)各一支,用10mL的塑料注射器(5.16)分别吸 取10mL和5mL的SPE上样液(5.7),分别冲洗硅胶固相萃取柱和氨基固相萃取柱,使固相吸附剂完 全被液体溶剂浸润,应防止干涸,但溶剂的液面也不能高于固相吸附剂。然后将氨基固相萃取柱连接在 硅胶固相萃取柱的上端,形成串联双柱。 8.1.2 固相萃取 称取0.5g芝麻油样品,精确至1mg,用2mLSPE上样液(5.7)充分溶解,用5mL的塑料注射器 (5.16)吸取样液后,以(1~2)滴/s的速度通过串联双柱(8.1.1)。上样过程中应保持串联双柱处于溶剂 浸润状态,防止干涸。弃去流出的液体;再用同一支5mL的塑料注射器吸取5mL的SPE上样液,以 2滴/s左右的速度洗涤双柱,并用空气吹干上端的氨基固相萃取柱,同时保持下层的硅胶固相萃取柱处 于溶剂浸润状态,弃去洗涤液,取下上端氨基固相萃取柱;仍用同一支5mL的塑料注射器吸取3mL的 SPE上样液,以(1~2)滴/s的速度单独洗涤硅胶固相萃取柱,并保持硅胶固相萃取柱处于溶剂浸润状 态,弃去洗涤液;仍用同一支5mL的塑料注射器吸取2mL的SPE淋洗液(5.8),以(1~2)滴/s的速度 单独洗涤硅胶固相萃取柱,并用空气吹干硅胶固相萃取柱,弃去洗涤液;最后取1支干净的10mL的塑 料注射器(5.16)吸取10mL的SPE洗脱液(5.9),以(2~3)滴/s的速度洗脱硅胶固相萃取柱,并用空气 吹干硅胶固相萃取柱,收集全部洗脱液于一个25mL的棕色容量瓶(5.14)中,并用异丙醇(5.6)定容,作 为样品提取液[或者收集全部洗脱液于一支15mL的试管(5.15)中,然后置于50℃的氮气吹干仪(6.6) 的水浴中,氮气吹干溶剂后,用异丙醇溶解残留物,转移入25mL棕色容量瓶,再用异丙醇定容为样品 提取液]。样品提取液用碟形过滤器(6.3)过滤后进行液相色谱测定。 8.2 高效液相色谱测定 8.2.1 高效液相色谱参考条件 高效液相色谱检测的参考条件如下: a) 色谱柱:VenusilXBPC18柱(长250mm,内径4.6mm,填料粒径5μm)及其配套保护柱(也可 使用其他品牌等效的C18液相色谱柱); b)进样量:20μL; c)流动相:甲醇+水(5.13); d)流速:1mL/min; e)柱温:30℃; f)紫外检测器波长:287nm。 8.2.2 样品测定 用微量进样器(6.5)分别吸取等体积的各个芝麻素和芝麻林素标准工作溶液(5.13)以及样品提取 液(8.1.2)进行分析,测定峰面积,以各个标准工作液的芝麻素或芝麻林素的浓度为横坐标,对应的芝麻 素或芝麻林素的峰面积为纵坐标,分别绘制芝麻素和芝麻林素的标准工作曲线,并求得样品提取液相应 的芝麻素或芝麻林素的浓度(c)。 芝麻素和芝麻林素的标准品及样品测定的色谱图见附录B。 3GB/T31579—2015 9 结果计算 芝麻素和芝麻林素的含量分别按式(1)进行计算: X=c×V m×1000……………………………(1) 式中: X———样品中芝麻素或芝麻林素的含量,单位为毫克每克(mg/g); c———通过标准工作曲线获得的样品提取液中的芝麻素或芝麻林素的浓度,单位为毫克每升(mg/L); V———样品提取液的定容体积,单位为毫升(mL); m———样品的称样量,单位为克(g)。 计算结果保留至小数点后两位。 10 精密度 根据GB/T6379.1—2004和GB/T6379.2—2004的相关要求,芝麻素和芝麻林素的检测精密度以 实验室间的比对实验的统计分析结果表示,详见表1和表2。 表1 芝麻素的检测精密度 项目 样品1 样品2 样品3 参加比对的实验室的数量 10 10 10