ICS67.120.30 X20 中华人民共和国国家标准 GB/T31520—2015 红球藻中虾青素的测定 液相色谱法 DeterminationofastaxanthininHaematococcus— Highperformanceliquidchromatographymethod 2015-05-15发布 2015-05-15实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会水产品加工分技术委员会(SAC/TC156/SC3)归口。 本标准起草单位:中国水产科学研究院黄海水产研究所、云南爱尔发生物技术有限公司。 本标准主要起草人:孙伟红、张勇、冷凯良、徐春媚、刘建国、吴秋瑾、邢丽红、苗均魁、肖荣辉、孙来娣、 翟毓秀、许洋。 ⅠGB/T31520—2015 红球藻中虾青素的测定 液相色谱法 1 范围 本标准规定了红球藻(Haematococcus)中虾青素的液相色谱测定方法。 本标准适用于雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)藻粉中虾青素含量的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 试样经二氯甲烷与甲醇混合溶液提取,氢氧化钠甲醇溶液皂化,使其中的虾青素酯转化成游离态的 虾青素,经C30反相液相色谱柱分离后,用配有紫外检测器的液相色谱仪测定,外标法定量。 4 试剂 所用试剂除另有规定外均为色谱纯。 4.1 试验用水应符合GB/T6682中一级水的要求。 4.2 丙酮。 4.3 磷酸:优级纯。 4.4 氢氧化钠:优级纯。 4.5 甲醇。 4.6 二氯甲烷。 4.7 叔丁基甲基醚。 4.8 2,6-二叔丁基对甲酚:化学纯。 4.9 1%磷酸溶液(体积分数):量取10mL磷酸(4.3)和990mL水,混匀后备用。 4.10 二氯甲烷-甲醇溶液:量取250mL二氯甲烷和750mL甲醇,加入0.5g2,6-二叔丁基对甲酚 (4.8),混匀后备用。 4.11 0.1mol/L氢氧化钠-甲醇溶液:称取0.4g氢氧化钠(4.4),用甲醇溶解并稀释至100mL,混匀后 备用。 4.12 2%磷酸-甲醇溶液(体积分数):量取2mL磷酸(4.3)和98mL甲醇,混匀后备用。 4.13 全反式虾青素、13-顺虾青素、9-顺虾青素标准品:纯度≥95%。 4.14 全反式虾青素标准储备溶液:准确称取全反式虾青素标准品约10mg,用丙酮溶解并定容于 500mL容量瓶中,此溶液浓度为20μg/mL,充氮密封,置-18℃冰箱中避光保存,有效期1个月。 1GB/T31520—2015 4.15 13-顺虾青素标准储备溶液:准确称取13-顺虾青素标准品约1mg,用丙酮溶解并定容于50mL 容量瓶中,此溶液浓度为20μg/mL,充氮密封,置-18℃冰箱中避光保存,有效期1个月。 4.16 9-顺虾青素标准储备溶液:准确称取9-顺虾青素标准品约1mg,用丙酮溶解并定容于50mL容 量瓶中,此溶液浓度为20μg/mL,充氮密封,置-18℃冰箱中避光保存,有效期1个月。 4.17 全反式虾青素标准工作溶液:准确移取适量全反式虾青素标准储备溶液(4.14)用丙酮稀释成浓 度分别为0.1μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL的标准工作液,现 配现用。 4.18 13-顺虾青素标准工作溶液:准确移取13-顺虾青素标准储备溶液(4.15),用丙酮配制成适当浓度 的标准工作液,用于定性,现配现用。 4.19 9-顺虾青素标准工作溶液:准确移取9-顺虾青素标准储备溶液(4.16),用丙酮配制成适当浓度的 标准工作液,用于定性,现配现用。 5 仪器 5.1 高效液相色谱仪:配紫外检测器。 5.2 分析天平:感量0.00001g、0.0001g各一台。 5.3 超声波清洗机。 5.4 冷冻离心机:8000r/min。 5.5 旋涡混合器。 5.6 氮吹仪。 5.7 具塞聚丙烯离心管:50mL。 5.8 棕色容量瓶:50mL。 5.9 棕色比色管:10mL。 5.10 玻璃匀浆器:10mL。 6 测定步骤 6.1 提取 准确称取雨生红球藻粉50mg~100mg(精确到0.1mg),置于干燥的玻璃匀浆器中,加入1mL二 氯甲烷-甲醇溶液(4.10)充分研磨使细胞壁破碎完全,转移至50mL离心管中,用10mL二氯甲烷-甲醇 溶液(4.10)分3次清洗玻璃匀浆器,合并提取液。超声提取5min,5℃下8000r/min离心5min,将上 清液转移至50mL容量瓶中,离心管中再加入10mL二氯甲烷-甲醇溶液(4.10),重复上述步骤3次以 上,直到提取后的藻渣为白色,合并上清液,用二氯甲烷-甲醇溶液(4.10)定容至50mL,然后静置 15min。准确移取5mL上清液于另一50mL容量瓶中,用二氯甲烷-甲醇溶液(4.10)稀释并定容,备用。 注:虾青素含量高于2%的雨生红球藻粉的称样量不大于50mg。 6.2 皂化 从上述容量瓶中准确移取5mL溶液于10mL比色管中,加入0.7mL氢氧化钠-甲醇溶液(4.11), 涡旋混合,充氮密封,在5℃冰箱中反应过夜12h~14h。然后在反应液中加入0.4mL2%磷酸-甲醇 溶液(4.12)中和剩余的碱,混匀,在氮气吹扫下定容至5mL,过0.45μm滤膜,滤液作为试样溶液。 注:若试样溶液的色谱图中,在20min~30min的出峰处存在杂峰,将加碱量提高一倍后重新取提取液皂化。 2GB/T31520—2015 6.3 测定 6.3.1 色谱条件 6.3.1.1 色谱柱:C30色谱柱,250mm×4.6mm,5μm,或相当者。 6.3.1.2 柱温:25℃。 6.3.1.3 检测器:检测波长为474nm。 6.3.1.4 进样量:20μL。 6.3.1.5 流速:1.0mL/min。 6.3.1.6 流动相:梯度洗脱程序见表1。 表1 流动相梯度洗脱程序 时间/min A/% B/% C/% 0 81 15 4 15 66 30 4 23 16 80 4 27 16 80 4 30 81 15 4 35 81 15 4 注:A为甲醇,B为叔丁基甲基醚,C为1%磷酸溶液。 6.3.2 定性方法 分别注入20μL适当浓度的全反式虾青素标准工作液(4.17)、13-顺虾青素标准工作液(4.18)、9-顺 虾青素标准工作液(4.19)及试样溶液(6.2),按6.3.1列出的色谱条件进行液相色谱分析测定,根据标准 工作液色谱图中三种虾青素同分异构体组分的保留时间定性。标准品色谱图参见附录A。 6.3.3 定量方法 根据试样溶液中虾青素的含量情况,选定峰面积相近的全反式虾青素的标准工作液单点定量或多 点校准定量,试样测定结果以三种虾青素同分异构体的总和计,外标法定量,同时标准工作液和样液的 响应值均应在仪器检测的线性范围之内。 7 结果计算 试样中虾青素的含量(X)以质量分数计(%),按式(1)计算,保留3位有效数字。 X=(1.3×A13-cis+Atrans+1.1×A9-cis)×Cs×V×10-3 As×m×f×100%………(1) 式中: X ———样品中虾青素的含量,%; 3GB/T31520—2015 1.3———13-顺虾青素对全反式虾青素的校正因子; A13-cis———试样溶液中13-顺虾青素的峰面积; Atrans———试样溶液中全反式虾青素的峰面积; 1.1———9-顺虾青素对全反式虾青素的校正因子; A9-cis———试样溶液中9-顺虾青素的峰面积; Cs———标准工作液中全反式虾青素的含量,单位为微克每毫升(μg/mL); V———试样溶液体积,单位为毫升(mL); As———全反式虾青素标准工作液的峰面积; m———样品质量,单位为毫克(mg); f———稀释倍数,为100。 8 方法的灵敏度、准确度和精密度 8.1 灵敏度 本方法的定量限为500mg/kg。 8.2 准确度 雨生红球藻中全反式虾青素添加浓度为500mg/kg~2000mg/kg时,回收率为90%~110%。 8.3 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。 4GB/T31520—2015 附 录 A (资料性附录) 色 谱 图 A.1 虾青素同分异构体标准溶液色谱图 图A.1 虾青素同分异构体标准溶液色谱图(5.0mg/L) A.2 雨生红球藻试样溶液色谱图 图A.2 雨生红球藻试样溶液的色谱图 5GB/T31520—2015