ICS07.080 G85 中华人民共和国国家标准 GB/T30986—2014 生化制品中葡萄糖、蔗糖、麦芽糖 含量的测定 液相色谱示差折光法 Methodforthedeterminationofglucose,sucrose,maltosecontentsin biochemicalproducts—Liquidchromatographywithrefractiveindexdetector 2014-07-24发布 2015-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布目 次 前言 Ⅲ ………………………………………………………………………………………………………… 1 范围 1 ……………………………………………………………………………………………………… 2 规范性引用文件 1 ………………………………………………………………………………………… 3 方法提要 1 ………………………………………………………………………………………………… 4 试剂和溶液 1 ……………………………………………………………………………………………… 5 仪器与设备 1 ……………………………………………………………………………………………… 6 试样的制备 2 ……………………………………………………………………………………………… 7 分析步骤 2 ………………………………………………………………………………………………… 8 结果计算 2 ………………………………………………………………………………………………… 附录A(资料性附录) 葡萄糖、蔗糖、麦芽糖标准物质色谱图 4 ………………………………………… ⅠGB/T30986—2014 前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由成都大学提出。 本标准由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)归口。 本标准起草单位:成都大学中药化学实验室、中国测试技术研究院。 本标准主要起草人:苟小军、谭和平、颜军、孙登峰、谢贞建。 ⅢGB/T30986—2014 生化制品中葡萄糖、蔗糖、麦芽糖 含量的测定 液相色谱示差折光法 1 范围 本标准规定了用液相色谱示差折光法测定生化制品中葡萄糖、蔗糖、麦芽糖含量的方法。 本标准适用于含糖胃蛋白酶、静脉注射用人免疫球蛋白、狂犬病人免疫球蛋白等生化制品中葡萄 糖、蔗糖、麦芽糖的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 方法提要 试样经水溶解,加热除蛋白,离心,取上清液用体积分数40%乙腈水溶液定容至一定体积,经 0.45μm滤膜过滤,用液相色谱示差折光检测器测定,保留时间定性、外标法定量。 4 试剂和溶液 4.1 除非另有规定,使用的试剂为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。 4.2 乙腈:色谱纯。 4.3 体积分数40%乙腈水溶液:取40mL色谱纯乙腈与60mL水混合。 4.4 葡萄糖(CAS号:50-99-7)标准品:纯度≥99%。 4.5 蔗糖(CAS号:57-50-1)标准品:纯度≥99%。 4.6 麦芽糖(CAS号:69-79-4)标准品:纯度≥99%。 4.7 糖标准储备液:分别称取5g(准确至0.0001g)经减压干燥至恒重的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖标准品, 加适量体积分数40%乙腈水溶液溶解,各转移至100mL容量瓶中,用体积分数40%乙腈水溶液定容 至刻度,摇匀。糖标准储备液质量浓度为50.0mg/mL。 4.8 糖标准溶液:分别准确吸取糖标准储备溶液0.5mL,1.0mL,2.5mL,5.0mL,7.5mL,10.0mL至 50mL容量瓶中,用体积分数40%乙腈水溶液稀释至刻度。制成质量浓度分别为0.5mg/mL,1.0mg/mL, 2.5mg/mL,5.0mg/mL,7.5mg/mL,10.0mg/mL的葡萄糖、蔗糖及麦芽糖标准溶液。 5 仪器与设备 5.1 高效液相色谱仪:配示差折光检测器。 5.2 分析天平,感量0.1mg。 5.3 高速离心机,10000r/min。 1GB/T30986—2014 5.4 有机相微孔过滤器,0.45μm。 5.5 常用玻璃量器,A级。 6 试样的制备 6.1 蛋白热变性去除 准确称取0.5g(精确至0.0001g)研磨成粉末状的固体试样或准确移取1mL(精确至0.01mL)液 体试样于20mL试管中,用40%乙腈水溶液(4.3)10mL溶解,于沸水浴中加热10min。冷却后以 10000r/min离心10min。 6.2 试液制备 将上清液(6.1)转移至50mL容量瓶中,用40%乙腈水溶液(4.3)定容至刻度,摇匀,待测。 对于不含蛋白的试样,直接称取0.5g(精确至0.0001g)研磨成粉末状固体试样或量取1mL(精确 至0.01mL)液体试样置于50mL容量瓶中,用40%乙腈水溶液(4.3)定容至刻度,待测。 7 分析步骤 7.1 液相色谱参考条件 色谱柱:糖分析专用色谱柱,或氨基柱。 流动相:乙腈+水(78+22)。 流量:1.0mL/min。 柱温:30℃。 检测器池温度:35℃。 进样量:20μL。 7.2 绘制标准曲线 分别吸取葡萄糖、蔗糖、麦芽糖系列标准溶液,用0.45μm滤膜过滤,注入高效液相色谱仪,进样 20μL,进行测定,以各标准溶液浓度峰面积为纵坐标,以标准溶液标准浓度值为横坐标,绘制各物质的 标准曲线。用最小二乘法计算标准曲线公式,标准曲线的相关系数应不小于0.999。葡萄糖、蔗糖、麦芽 糖标准物质色谱图参见附录A中图A.1。 7.3 样品分析 吸取试料溶液(6.2),用0.45μm滤膜过滤,注入高效液相色谱仪,在与7.2相同条件下进行测定。 根据色谱峰面积,利用线性回归方程计算试料溶液中葡萄糖、蔗糖、麦芽糖的含量。每个样品测定3次, 以平均值作为测量结果。 7.4 空白试验 除不加入样品外,均按上述步骤进行。 8 结果计算 固体试样中葡萄糖、蔗糖、麦芽糖的含量(质量分数)按式(1)和式(2)计算: 2GB/T30986—2014 ρ=A-a b…………………………(1) w=ρ×V mi…………………………(2) 式中: ρ———从标准曲线求得试料的质量浓度,单位为毫克每毫升(mg/mL); A———试料的色谱峰面积; a———标准曲线截距; b———标准曲线斜率; w———样品中被测组分质量分数,单位为毫克每克(mg/g); V———试料溶液定容体积,单位为毫升(mL); mi———称取试料的质量,单位为克(g)。 液体试样中葡萄糖、蔗糖、麦芽糖的质量浓度按式(3)计算: ρi=ρ×V Vi…………………………(3) 式中: ρi———试样中被测组分质量浓度,单位为毫克每毫升(mg/mL); ρ———从标准曲线求得试料的质量浓度,单位为毫克每毫升(mg/mL); V———试料溶液定容体积,单位为毫升(mL); Vi———移取试料的体积,单位为毫升(mL)。 3GB/T30986—2014 附 录 A (资料性附录) 葡萄糖、蔗糖、麦芽糖标准物质色谱图 葡萄糖、蔗糖、麦芽糖标准物质色谱图,见图A.1。 说明: 12.003min为葡萄糖;17.203min为蔗糖;21.220min为麦芽糖。 图A.1 葡萄糖、蔗糖、麦芽糖标准物质色谱图 4GB/T30986—2014