ICS65.120 B46 中华人民共和国国家标准 GB/T30957—2014 饲料中赭曲霉毒素A的测定 免疫亲和柱净化-高效液相色谱法 DeterminationofochratoxinAinfeeds— Highperformanceliquidchromatographywithimmunoaffinitycolumnclean-up 2014-07-08发布 2015-01-10实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)归口。 本标准由农业部饲料质量监督检验测试中心(南昌)、中国农业科学院农业质量标准与检测技术研 究所[国家饲料质量监督检验中心(北京)]、上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所负责 起草。 本标准主要起草人:饶辉、文虹、周华娇、符金华、徐田放、饶正华、尹腾桂、杨琳芬、邢磊、赵薇娜、 赵志辉。 ⅠGB/T30957—2014 饲料中赭曲霉毒素A的测定 免疫亲和柱净化-高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了饲料中赭曲霉毒素A的免疫亲和柱净化-高效液相色谱测定方法。 本标准适用于饲料原料、配合饲料、浓缩饲料、精料补充料中赭曲霉毒素A的测定。 本标准定量限为5.0μg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1 饲料 采样 GB/T20195 动物饲料 试样的制备 3 原理 试样经过甲醇-水提取,提取液经过滤、稀释后,滤液经过含有赭曲霉毒素A特异抗体的免疫亲和 层析柱层析净化,用PBS缓冲液和纯水清洗,甲醇洗脱,洗脱液通过带荧光检测器的高效液相色谱仪测 定赭曲霉毒素A的含量。 4 试剂 除特殊说明外,所用试剂均为分析纯试剂,用水符合GB/T6682中二级用水的规定。 4.1 甲醇:色谱级。 4.2 乙腈:色谱级。 4.3 氯化钠。 4.4 磷酸氢二钠。 4.5 磷酸二氢钾。 4.6 氯化钾。 4.7 盐酸。 4.8 碳酸氢钠。 4.9 吐温-20(Tween-20)。 4.10 乙酸。 4.11 清洗缓冲液:将25g氯化钠(4.3),5g碳酸氢钠(4.8)溶于水中,加入0.1mL吐温-20(4.9),加水 稀释至1L。 4.12 PBS缓冲液:称取8.0g氯化钠(4.3)、1.2g磷酸氢二钠(4.4)、0.2g磷酸二氢钾(4.5)、0.2g氯化 钾(4.6)溶于900mL水中,用浓盐酸(4.7)调节pH值至7.0,用水定容为1L。 1GB/T30957—2014 4.13 提取液:甲醇+水(8+2):将800mL甲醇(4.1)与200mL水混合均匀。 4.14 HPLC流动相:量取495mL乙腈(4.2)至1000mL的容量瓶中,加入10mL乙酸(4.10),用水定 容至1000mL。混合均匀并通过0.45μm滤膜,备用。 4.15 赭曲霉毒素A(OchratoxinA)标准品:纯度≥99%。 4.16 赭曲霉毒素A标准储备液:准确称取适量的赭曲霉毒素A标准品,用甲醇配成浓度为0.1mg/mL 的标准储备液,-20℃冰箱中贮存,可使用12个月。 4.17 赭曲霉毒素A标准中间液(5.0μg/mL):准确移取5.0mL赭曲霉毒素A标准储备液(4.16)于 100mL容量瓶中,用甲醇(4.1)稀释并定容至刻度。该溶液保存于2℃~8℃冰箱里,可使用3个月。 4.18 赭曲霉毒素A标准工作液:赭曲霉毒素A标准中间液(4.17)用流动相(4.14)稀释,配制0.5μg/L、 2.5μg/L、10μg/L、50μg/L、100μg/L浓度的赭曲霉毒素A标准工作液。赭曲霉毒素A标准工作液 储藏在2℃~8℃冰箱里,可使用7天。 5 仪器和设备 除实验室常用设备外,还需要以下仪器和设备: 5.1 免疫亲和柱,容量≥0.1μg赭曲霉毒素A,回收率≥85%。 5.2 振荡器。 5.3 氮吹仪。 5.4 高速均质器:18000r/min~22000r/min。 5.5 高效液相色谱,配有荧光检测器。 5.6 真空装置或空气压力泵,符合免疫亲和柱的要求。 5.7 玻璃纤维滤纸,直径21mm、125mm,无荧光特性。 6 试样的制备 按GB/T14699.1采集有代表性的样品,按GB/T20195进行样品制备。粉碎过1mm孔筛,混合 均匀,装入密闭容器,低温保存备用。 7 分析步骤 7.1 样品处理 7.1.1 提取 准确称取粉碎试样25.0g(精确到0.1g)于250mL具塞锥形瓶中,加入5.0g氯化钠,加入100mL 提取液(4.13)。将搅拌杯置于均质器(5.4)上,高速搅拌提取2min,或振荡器(5.2)振荡60min。提取 液经定性快速滤纸过滤于干净的烧杯中。准确移取5.0mL滤液并加入45.0mLPBS缓冲液(4.12)稀 释,混合均匀,经玻璃纤维滤纸(5.7)过滤至澄清后,随即进行免疫亲和柱净化操作。 7.1.2 净化 将免疫亲和柱(5.1)连接于10mL玻璃定量管下。准确移取10.0mL样品提取液于玻璃定量管 中,调节压力使溶液以不超过2mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱,直至3mL以上空气通过柱体。分 别以10mL清洗缓冲液(4.11)、10mL水清洗免疫亲和柱,弃去全部流出液,并使3mL以上空气通过 免疫亲和柱。准确加入1.5mL甲醇(4.1)洗脱,流速不超过1mL/min,收集洗脱液于玻璃试管中,加入 2GB/T30957—2014 1.5mL水,定容至3.0mL(V),混匀后,过0.45μm滤膜,供高效液相色谱测定。 7.2 测定 7.2.1 液相色谱测定参考条件 色谱柱:C18柱,柱长150mm,内径4.6mm,填料直径5μm,或相当者; 流动相:见4.14; 流速:1.0mL/min; 检测波长:激发波长333nm;发射波长477nm; 进样量:20μL; 柱温:25℃。 7.2.2 色谱测定 分别取试样溶液和标准工作液各20μL(或相同体积)注入高效液相色谱仪进行测定,以标准工作 液浓度为横坐标,以峰面积积分值为纵坐标,绘制标准工作曲线,以保留时间定性,用标准工作曲线对试 样进行定量。赭曲霉毒素A标准溶液色谱图参见附录A。 8 结果计算与表示 8.1 结果计算 试样中赭曲霉毒素A含量,以质量分数X计,单位为微克每千克(μg/kg),按式(1)计算: X=c×V m×n …………………………(1) 式中: c———试样溶液中赭曲霉毒素A的含量,单位为微克每升(μg/L); V———上机液的定容液体积,单位为亳升(mL); m———试样称取量,单位为克(g); n———稀释倍数。 8.2 结果表示 测定结果用平行测定的算术平均值表示,计算结果表示到小数点后一位。 9 重复性 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。GB/T30957—2014 GB/T30957—2014 附 录 A (资料性附录) 赭曲霉毒素A的标准品色谱图 赭曲霉毒素A的标准品色谱图参见图A.1。 图A.1 5.0μg/kg赭曲霉毒素A标准品的液相色谱图 4102 — 75903T / BG