ICS65.120 B46 中华人民共和国国家标准 GB/T30955—2014 饲料中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定 免疫亲和柱净化-高效液相色谱法 DeterminationofaflatoxinB1,B2,G1,G2contentinfeeds— Highperformanceliquidchromatographywithimmunoaffinitycolumnclean-up 2014-07-08发布 2015-01-10实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)归口。 本标准起草单位:浙江大学饲料科学研究所、中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所[国 家饲料质量监督检验中心(北京)]、北京中检维康技术有限公司。 本标准主要起草人:余东游、饶正华、李卫芬、李兰、王雄、果旗、梁权。 ⅠGB/T30955—2014 饲料中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定 免疫亲和柱净化-高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了饲料中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的免疫亲和层析净化-高效液相色谱法的测定 方法。 本标准适用于饲料中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定。 本标准的检测限:黄曲霉毒素B1为0.2μg/kg,黄曲霉毒素B2为0.2μg/kg,黄曲霉毒素G1为 0.3μg/kg,黄曲霉毒素G2为0.3μg/kg。 本标准的定量限:黄曲霉毒素B1为1.0μg/kg,黄曲霉毒素B2为1.0μg/kg,黄曲霉毒素G1为 1.0μg/kg,黄曲霉毒素G2为1.0μg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1 饲料 采样 GB/T20195 动物饲料 试样的制备 3 原理 试样经过甲醇-水提取后,提取液经过滤、稀释后,滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层 析柱层析净化,经高效液相色谱仪分离,荧光检测器柱后光化学衍生测定黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的 含量。 4 试剂 除非另有说明,均为分析纯的试剂;实验室用水符合GB/T6682中二级用水规定,标准溶液和流动 相用水符合一级用水规定。 4.1 甲醇:色谱纯。 4.2 苯:色谱纯。 4.3 乙腈:色谱纯。 4.4 甲醇+水(8+2):取80mL甲醇(4.1)加20mL水,混合均匀。 4.5 甲醇+水(45+55):取45mL甲醇(4.1)加55mL水,混合均匀。 4.6 苯+乙腈(98+2):取2mL乙腈(4.3)加入98mL苯(4.2),混合均匀。 4.7 黄曲霉毒素标准储备溶液:用苯+乙腈(98+2)溶液(4.6)分别配制0.100mg/mL的黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2标准储备液,保存于4℃备用,可使用1年。 4.8 黄曲霉毒素混合标准工作液:准确移取适量的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准储备溶液(4.7), 1GB/T30955—2014 50℃下,氮气吹干仪吹干,用适量的甲醇+水(45+55)溶液(4.5)定容为混合标准工作液,黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2各分别为0ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL。 4.9 PBS缓冲溶液:称取8.0g氯化钠,1.2g磷酸氢二钠,0.2g磷酸二氢钾,0.2g氯化钾,用990mL 纯水溶解,然后用浓盐酸调节pH值至7.0,最后用纯水稀释至1000mL。 4.10 次氯酸钠。 5 仪器和设备 实验室常规仪器、设备、材料及下列各项。 5.1 高速均质器,18000r/min~22000r/min,或震荡器。 5.2 黄曲霉毒素免疫亲和柱,柱容量≥300ng。 5.3 玻璃纤维滤纸,直径11cm,孔径1.5μm。 5.4 玻璃定量管,10mL。 5.5 氮吹仪,50℃。 5.6 光化学衍生系统。 5.7 高效液相色谱仪,带荧光检测器。 6 试样采集与制备 按GB/T14699.1采样;按GB/T20195用四分法缩减至500g,粉碎后过1mm孔径的分析筛,混 匀后装入密闭容器,冷藏保存。 7 分析步骤 7.1 提取 称取试样(粒度小于1mm)50.0g于250mL具塞锥形瓶中,加入5.0g氯化钠及准确加入100.0mL (V1)甲醇+水(8+2)溶液(4.4),以均质器高速搅拌提取2min,或震荡器震荡30min。定量滤纸过滤, 准确移取10.0mL(V2)滤液并加入40.0mL(V3)PBS缓冲溶液(4.9)稀释,用玻璃纤维滤纸过滤1~2次,至 滤液澄清,备用。 7.2 净化 将免疫亲和柱连接于10.0mL玻璃定量管下。准确移取10.0mL(V4)样品提取液注入玻璃定量管 中,将空气压力泵与玻璃定量管连接,调节压力使溶液以不超过2mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱, 待溶液全部流出后,以10.0mL纯水清洗柱子2次,弃去全部流出液。准确加入1.0mL(V)甲醇(4.1) 洗脱,流速不超过1mL/min,收集全部洗脱液于玻璃试管中,加纯水定容为2.0mL,供色谱检测用。 7.3 测定 7.3.1 色谱条件 色谱柱:C18柱,长150mm,内径4.6mm,填料直径5μm,或相当者。 流动相:甲醇+水(45+55)溶液(4.5)。 流速:0.8mL/min。 检测波长:激发波长360nm;发射波长440nm。 2GB/T30955—2014 光化学衍生系统。 柱温:30℃。 进样量:20μL。 7.3.2 色谱测定 分别取相同体积样液和标准工作溶液注入高效液相色谱仪,在上述色谱条件下测定试样的响应值 (峰高或峰面积)。经过与黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准溶液谱图比较响应值得到试样中黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的浓度c(μg/L)。标准品色谱图参见附录A。 警告———黄曲霉毒素是高致癌性物质,应十分小心处理。使用过的玻璃容器及黄曲霉毒素溶液用 5%浓度次氯酸钠溶液浸泡过夜。 8 结果计算与表述 8.1 结果计算 试样中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2含量以质量分数Xi计,单位为微克每千克(μg/kg),按式(1) 计算: Xi=Pi×Vi×ci×Vst Pst×m×Vi×103……………………………(1) 式中: Pi———试样溶液中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2各组分的峰面积值; Vi———样品的总稀释体积,单位为毫升(mL); ci———黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2各标准溶液浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL); Vst———标准溶液的进样体积(μL); Pst———黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2各标准溶液峰面积平均值; m———试样质量,单位为克(g)。 8.2 结果表示 测定结果用平行测定的算术平均值表示,计算结果表示到小数点后一位。 9 重复性 在重复性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于其算术平均值的15%。GB/T30955—2014 GB/T30955—2014 附 录 A (资料性附录) 标准品色谱图 黄曲霉毒素标准溶液色谱图见图A.1。 图A.1 黄曲霉毒素标准溶液(B110μg/L、B210μg/L、G110μg/L、G210μg/L)色谱图 4102 — 55903T / BG