ICS65.120 B46 中华人民共和国国家标准 GB/T30945—2014 饲 饲料中泰乐菌素的测定 高效液相色谱法 Determinationoftylosininfeeds— Highperformanceliquidchromatography 2014-07-08发布 2015-01-08实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)归口。 本标准起草单位:农业部饲料质量监督检验测试中心(西安)。 本标准主要起草人:张眉、贾青、李会玲、冯西辉、王均良、郭洁、李胜。 ⅠGB/T30945—2014 饲料中泰乐菌素的测定 高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了以高效液相色谱(HPLC)仪测定饲料中泰乐菌素的方法。 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料中泰乐菌素的测定,本方法定量限 为1mg/kg。 本标准不适用于添加尿素的饲料。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1 饲料 采样 GB/T20195 动物饲料 试样的制备 3 原理 试样中的泰乐菌素经二氯甲烷提取后,过滤,滤液经HLB小柱净化、浓缩,注入高效液相色谱仪进 行分离,用紫外检测器检测,外标法定量。 4 试剂和材料 除特殊说明外,所用试剂均为分析纯试剂,用水符合GB/T6682中一级用水的规定。 4.1 甲醇。 4.2 乙腈:色谱纯。 4.3 甲醇:色谱纯。 4.4 二氯甲烷。 4.5 正己烷。 4.6 氨水。 4.7 乙腈溶液(50%):取乙腈(4.2)100mL与100mL水混合。 4.8 盐酸溶液(1mol/L):取9mL盐酸于100mL容量瓶中,用水稀释并定容。 4.9 泰乐菌素标准品:纯度≥98%。 4.10 0.005mol/L磷酸二氢铵缓冲液:准确称取0.5751g磷酸二氢铵于1000mL容量瓶中,加水溶 解并定容,过0.45μm滤膜。 4.11 淋洗液:含2%氨水5%甲醇的水溶液,吸取2mL氨水(4.6)、5mL甲醇(4.1),用水稀释至 100mL。 4.12 乙酸钠缓冲液(pH=5.5,0.15mol/L):称取12.30g无水乙酸钠于1000mL量瓶中,加900mL 1GB/T30945—2014 水,使溶解,用1mol/L的盐酸溶液(4.8)调节pH至5.5,用水定容。 4.13 HLB固相萃取小柱1)(200mg,3mL)。 1)Oasis®HLB固相萃取小柱是由WatersCorperation(34MaplestreetMilfordMA.USA)提供的产品的商品名 称,给出这一信息是为了给本标准使用者提供方便,而不是标准主管部门对这一产品的认可。4.14 泰乐菌素标准储备液:精密称定泰乐菌素标准品100mg(精确到0.01mg),于100mL容量瓶中, 加入50%乙腈(4.7)溶液使溶解,并定容,该溶液浓度为1mg/mL,置4℃冰箱中保存,该溶液有效期为 3个月。 4.15 泰乐菌素标准系列:分别吸取一定量的标准储备液(4.14),置于10mL容量瓶中,用乙腈(4.2)稀 释、定容,配制成浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、25.0μg/mL的标准工作液。 5 仪器设备 5.1 高效液相色谱仪(配紫外检测器)。 5.2 振荡器。 5.3 天平:精度为0.01g和0.00001g。 5.4 固相萃取装置。 5.5 超纯水处理器。 5.6 氮吹仪。 5.7 真空泵。 5.8 高速离心机。 5.9 旋转蒸发仪。 5.10 真空抽滤装置。 5.11 0.45μm微孔滤膜。 6 试样的制备 按GB/T14699.1采集有代表性的样品,按GB/T20195进行样品制备。粉碎过0.45mm孔筛,混 合均匀,装入密闭容器,低温保存备用。 7 分析步骤 7.1 样品处理 7.1.1 提取 准确称取2g~3g饲料样品(精确至0.01g),置于100mL具塞三角瓶中,加入25mL二氯甲烷 (4.4)于振荡器上振荡提取20min,用快速滤纸过滤,收集全部滤液于梨形瓶中,在45℃下于旋转蒸发 仪上蒸干溶剂,加0.5mL甲醇(4.1)溶解残渣,再加入pH=5.5的乙酸钠缓冲溶液(4.12)4.5mL,轻轻 摇匀,将此溶液转入20mL离心管中,用少量乙酸钠缓冲溶液(4.12)冲洗梨形瓶,洗液合并入离心管 中。在离心管中加入5mL正己烷(4.5),轻轻摇动离心管,防止乳化,于4000r/min离心5min,使分 层,弃去正己烷层,下层水相层备用。 7.1.2 净化 HLB小柱固定在固相萃取装置上,依次用5mL甲醇(4.3)和5mL超纯水活化柱子,将全部水相 2GB/T30945—2014 层加入小柱,让溶液自然流下,分别用5mL水和5mL淋洗液(4.11)淋洗,待淋洗液全部流出,抽干 HLB小柱中的液体,用5mL甲醇(4.3)洗脱,收集洗脱液于试管中,在氮气流下吹干,用1mL乙腈 (4.2)溶解残渣,过0.45μm滤膜,上机测定。 7.2 测定 7.2.1 色谱条件 色谱条件如下: a) 流动相:乙腈︰甲醇︰0.005mol/L磷酸二氢铵(4.10)=50︰35︰15。 b) 流速:0.6mL/min。 c) 柱温:25℃。 d) 检测器:紫外检测器。 e) 检测波长:290nm。 f) 色谱柱:symmetryshieldRP182),柱长250mm,内径3.9mm,或性能类似的色谱柱。 2)symmetryshieldRP18色谱柱是由WatersCorperation(34MaplestreetMilfordMA.USA)提供的产品的商品名 称,给出这一信息是为了给本标准使用者提供方便,而不是标准主管部门对这一产品的认可。g) 进样体积:20μL。 7.2.2 定量测定 分别取样品试液(7.1.2)和相应浓度的泰乐菌素标准工作液(4.15)按7.2.1的条件进行分析,以外标 法做单点或多点校正,以保留时间定性,峰面积定量,泰乐菌素标准溶液的色谱图参见附录A。 8 结果计算及表示 8.1 结果计算 试样中泰乐菌素的含量(X)以质量分数(mg/kg)表示,按式(1)计算: X=P×cS×V×1000 PS×m×1000…………………………(1) 式中: P———试样溶液中泰乐菌素的峰面积; cS———标准溶液浓度,单位为微克每毫升(μg/mL); V———试样定容体积,单位为毫升(mL); PS———标准溶液中泰乐菌素的峰面积; m———试样质量,单位为克(g)。 8.2 结果表示 测定结果用平行测定的算术平均值表示,计算结果保留3位有效数字。 9 重复性 同一分析者对同一试样同时两次平行测定结果的相对偏差不大于10%。GB/T30945—2014 GB/T30945—2014 附 录 A (资料性附录) 泰乐菌素标准溶液的液相色谱图 泰乐菌素标准溶液的液相色谱图见图A.1。 图A.1 泰乐菌素标准溶液的液相色谱图 4102 — 54903T / BG