ICS67.060 B20 中华人民共和国国家标准 GB/T26625—2011 粮 油检验 大豆异黄酮含量测定 高效液相色谱法 Inspectionofgrainandoils—Determinationofsoybeanisoflavone— Highperformanceliquidchromatography 2011-06-16发布 2011-11-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准的附录A、附录B为资料性附录。 本标准由国家粮食局提出。 本标准由全国粮油标准化技术委员会归口。 本标准起草单位:中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局、九三粮油工业集团有限公司。 本标准主要起草人:高勇、杨长志、李铁柱、张洪祥、邓立育、王乐、丁丽莎。 ⅠGB/T26625—2011 粮油检验 大豆异黄酮含量测定 高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了高效液相色谱法测定大豆异黄酮(大豆甙、黄豆黄素、染料木甙、大豆黄素、黄豆黄素 甙元、染料木素)含量的原理、试剂与材料、仪器与设备、试剂制备与保存、操作步骤、结果计算与表示、精 密度的要求。 本标准适用于大豆、豆奶粉、豆豉中大豆异黄酮含量的测定。 本标准测试方法的最低检测限为2.5mg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 试样用甲醇-水溶液超声波振荡提取,提取液经离心、浓缩、定容、过滤,用高效液相色谱仪测定,外 标法定量。 4 试剂与材料 除另有说明外,所用试剂均为分析纯,水应符合GB/T6682中一级水的规定。 4.1 乙腈:色谱纯。 4.2 甲醇。 4.3 乙酸。 4.4 90%甲醇溶液:取900mL甲醇,加入100mL水,混匀。 4.5 60%甲醇溶液:取600mL甲醇,加入400mL水,混匀。 4.6 10%甲醇溶液:取100mL甲醇,加入900mL水,混匀。 4.7 0.1%乙酸溶液:取1mL乙酸,置于1000mL容量瓶中,用水定容至刻度。 4.8 0.1%乙酸乙腈溶液:取1mL乙酸,置于1000mL容量瓶中,用乙腈溶解并定容至刻度。 4.9 大豆甙(daidzin):纯度不低于98%。 4.10 染料木甙(genistin):纯度不低于99%。 4.11 大豆黄素(daidzein):纯度不低于98%。 4.12 染料木素(genistein):纯度不低于98%。 4.13 黄豆黄素(glycitin):纯度不低于98%。 4.14 黄豆黄素甙元(glycitein):纯度不低于98%。 4.15 标准储备溶液配制: 4.15.1 大豆异黄酮标准储备溶液:分别准确称取适量的大豆甙、染料木甙、大豆黄素、染料木素、黄豆 黄素、黄豆黄素甙元标准品,分别用60%甲醇(4.5)配成浓度为1mg/mL的标准储备溶液。-18℃避 1GB/T26625—2011 光保存,有效期6个月。 4.15.2 大豆异黄酮混合标准中间溶液:分别移取上述各组分大豆异黄酮标准储备溶液(4.15.1) 0.5mL于同一10mL容量瓶中,用60%甲醇(4.5)定容至刻度,配制成各组分浓度为50μg/mL的大 豆异黄酮混合标准中间溶液,0℃~4℃冷藏避光保存,有效期3个月。 4.15.3 大豆异黄酮混合标准工作溶液:分别吸取50.0μL、100.0μL、200.0μL、300.0μL、1000.0μL 上述大豆异黄酮混合标准中间溶液(4.15.2)于10mL容量瓶中,用10%甲醇(4.6)溶液配成各组分浓 度0.25μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL、1.50μg/mL、5.00μg/mL系列的大豆异黄酮混合标准工 作溶液,0℃~4℃冷藏避光保存,有效期一周。 4.16 滤膜:0.45μm。 5 仪器和设备 5.1 高效液相色谱仪:配紫外检测器。 5.2 分析天平:感量0.01mg、感量0.01g。 5.3 旋转蒸发器。 5.4 超声波清洗器:50W。 5.5 离心机:10000r/min。 5.6 粉碎机。 5.7 组织捣碎机。 5.8 浓缩瓶:250mL。 5.9 样品筛:孔径2.0mm。 6 试样制备与保存 6.1 试样制备 6.1.1 大豆 取有代表性样品约500g,用粉碎机(5.6)粉碎使其全部通过孔径2.0mm样品筛(5.9),混匀,装入 洁净容器作为试样,密封备用。 6.1.2 豆豉 取有代表性样品约500g,用组织捣碎机(5.7)捣碎,混匀,装入洁净容器作为试样,密封备用。 6.2 试样保存 粉碎试样于4℃以下保存。试样制备过程中,应防止样品污染或组分变化。 7 操作步骤 7.1 提取 称取5g(精确到0.01g)试样于250mL具塞三角瓶中,加90mL90%甲醇溶液(4.4),置于超声波 清洗器(5.4)中60℃提取30min,在离心机(5.5)中10000r/min离心10min,上清液转移至250mL 浓缩瓶(5.8)中,残渣再加入60mL90%甲醇溶液进行提取,上清液也转入250mL浓缩瓶,在旋转蒸发 器(5.3)60℃浓缩至约40mL。浓缩液转入50mL容量瓶,用10%甲醇溶液(4.6)冲洗浓缩瓶并定容 至刻度。取1mL提取液通过0.45μm滤膜(4.16),供高效液相色谱仪测定。 7.2 色谱参考条件 色谱参考条件如下: a) 色谱柱:RPC18柱(250mm×4.6mm,5μm)或性能相当的色谱柱; b) 流动相:0.1%乙酸溶液(4.7)和0.1%乙酸乙腈溶液(4.8),按表1的规定进行梯度洗脱; c) 流速:1.0mL/min; 2GB/T26625—2011 d) 柱温:40℃; e) 波长:260nm; f) 进样量:20μL。 表1 梯度洗脱表 时间/min 0.1%乙酸水溶液/mL 0.1%乙酸乙腈溶液/mL 0 90 10 12.5 70 30 17.5 60 40 18.5 0 100 21.0 0 100 22.5 90 10 26.0 90 10 7.3 测定 参考上述色谱条件(7.2)调节高效液相色谱仪,使大豆异黄酮各组分的色谱峰完全分离。分别吸取 20μL适当浓度的大豆异黄酮混合标准工作液(4.15.3)和样液(7.1)进行液相色谱测定,分别得到大豆 异黄酮各组分的标准工作液峰面积(Asi)和样液大豆异黄酮各组分峰面积(Ai)。如果样液中大豆异黄 酮某一组分峰面积与标准工作溶液中的该组分峰面积相差较大时,稀释样液或调整标准工作液浓度后 再行测定。 在上述色谱条件下,大豆异黄酮各组分的保留时间约为:大豆甙8.2min、黄豆黄素8.8min、染料 木甙11.0min、大豆黄素15.3min、黄豆黄素甙元16.3min、染料木素19.4min。标准品的色谱图参见 附录A。 7.4 空白试验 除不加试样外,按7.1~7.3操作步骤进行测定。 8 结果计算与表示 8.1 大豆异黄酮各组分含量 按式(1)计算试样中大豆异黄酮各组分含量(mg/kg)。 Xi=Ai×Csi×V Asi×m………………………………(1) 式中: Xi———试样中某一大豆异黄酮组分含量,单位为毫克每千克(mg/kg); Ai———试样提取液中某一大豆异黄酮组分的峰面积; Asi———大豆异黄酮混合标准工作液中某一组分的峰面积; Csi———大豆异黄酮混合标准液中某一组分的浓度,单位为微克每毫升(μg/mL); V———试样提取液最终定容体积,单位为毫升(mL); m———试样质量,单位为克(g)。 注:计算结果应扣除空白值。 8.2 大豆异黄酮总含量 试样大豆异黄酮总含量为各组分之和,按式(2)计算: X=∑Xi ………………………………(2) 3GB/T26625—2011 式中: X———试样中总大豆异黄酮含量,单位为毫克每千克(mg/kg)。 注:本标准6种异黄酮已包括大豆中异黄酮的绝大部分组分,可认为是大豆异黄酮总含量。 8.3 结果表示 取两次测定结果绝对差值小于重复性限r的平均值为测定结果,单位为毫克每千克(mg/kg),保留 三位有效数字。如果两个独立测试结果的绝对差值超过重复性限r,应弃去该测试结果。再重新完成 两个独立测试。 9 精密度 9.1 重复性 在重复性条件下,获得的两个独立测试结果的绝对差值不得超过重复性限r。各组分大豆异黄酮 含量2.5mg/kg~30mg/kg范围内,其重复性限r计算方程参见附录B。 9.2 再现性 在再现性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过再现性限R。各组分大豆异黄酮 含量2.5mg/kg~30mg/kg范围内,其再现性限R计算方程参见附录B。 4GB/T26625—2011 附 录 A (资料性附录) 大豆异黄酮标准品液相色谱图 1———大豆甙; 2———黄豆黄素; 3———染料木甙; 4———大豆黄素; 5———黄豆黄素甙元; 6———染料木素。 图A.1 大豆异黄酮标准色谱图 5GB/T26625—2011 附 录 B (资料性附录) 精密度计算 本标准的精密度是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2规定的要求确定的,其重复性限r和再现性 限R以95%的可信度来计算。 表B.1 重复性限r和再现性限R计算方程 组分名称 含量范围/(mg/kg) 样品 重复性限r 再