ICS65.150 B51 中华人民共和国国家标准 GB/T26621—2011 日 本 对 虾 Kurumaprawn 2011-06-16发布 2011-11-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准的附录A和附录B为规范性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会海水养殖分技术委员会归口。 本标准起草单位:中国水产科学研究院黄海水产研究所。 本标准主要起草人:刘萍、李健、孔杰、刘志鸿、庄志猛、张岩、王清印。 ⅠGB/T26621—2011 日 本 对 虾 1 范围 本标准规定了日本对虾(Marsupenaeusjaponicus)的主要外部形态构造特征、生长与繁殖、遗传学 特性以及检测方法。 本标准适用于日本对虾的种质检测和鉴定。 2 学名与分类 2.1 学名 日本对虾Marsupenaeusjaponicus(Bate,1988)。 2.2 分类位置 甲壳纲(Crustacea),十足目(Decapoda),对虾科(Penaeidae),囊对虾属(Marsupenaeus)。 3 主要形态构造特征 3.1 外部特征 日本对虾甲壳光滑无毛,体上有十几条棕色和兰色相间的横带。附肢呈黄色,尾肢后部色泽鲜艳、 呈鲜兰色和黄色,边缘呈红色。额角侧沟很深,延伸至头胸甲的后缘。额角后脊较额角侧沟宽,具中央 沟。尾节背面有深的纵沟,末端尖,两侧有3对细小活动刺。肝脊和额胃脊明显。 日本对虾的外部形态见图1。 图1 日本对虾外部形态 雄虾第1腹肢的内肢变形特化成交接器,呈倒钟形,中叶末端形成横圆突起折向腹面,显著超出侧 叶末端,顶端稍圆,雄性交接器见图2。雄性附肢由2节构成,末端鳞片状,近乎椭圆形,长约为宽的 2倍,边缘着生细端刺。 雌虾第4对和第5对步足之间基部的腹甲上,有一囊状交接器为纳精囊,前端开口,其前方有一圆 突,见图3。 1GB/T26621—2011 图2 日本对虾雄性交接器(2.背面;1.腹面) 图3 日本对虾雌性交接器 3.2 可量性状 3.2.1 第1触角柄第1节的柄刺和外缘末端刺小而尖细,内侧附肢伸至第1节末,末节约为第2节长 度的1/3;第1触角触鞭很短,仅为头胸甲长的1/4,上鞭稍长于下鞭。 3.2.2 第2触角鳞片末缘略超出额角的末端,其触鞭长度约为体长的1.5倍。 3.2.3 第3颚足细长。雄性超出第1触角柄基节末端;雌性较短,不到末端;指节细小,雄性约为掌节 长的1/2,雌性约为指节长的2/3。 3.2.4 眼胃脊明显,占自眼眶边缘至肝刺间距离的3/5。 3.3 可数性状 额角齿式:上额角齿数/下额角齿数为8~10/1~2。 2GB/T26621—2011 4 生长繁殖特性 4.1 生长 由于雌雄对虾性成熟时间不同,因而雌雄对虾的生长类型显著不同。雌性、雄性日本对虾在南海北 部自然海区体长与体重关系式分别以式(1)和式(2)表示。 W♀=6.378×10-6L3.116…………………………(1) W♂=9.949×10-6L3.0295…………………………(2) 式中: W———体重,单位为克(g); L———体长,单位为毫米(mm)。 4.2 繁殖 4.2.1 生物学最小型 性成熟的最小体长为118mm,最小体重为20g。 4.2.2 交配与产卵 日本对虾产卵期较长,南海北部群体2月至8月均有性成熟个体出现,产卵高峰期在2月至5月。 在10月上旬至11月初雌虾最后一次蜕皮后进行交配,交配时雄虾将精荚投入雌虾交接器纳精囊内,外 覆翼状精荚栓。翌年春季产卵,纳精囊内精子与卵子同时排出。卵粒直径0.26mm~0.28mm,为沉 性卵,呈灰绿色或浅褐色。受精后卵膜举起,卵膜径0.33mm~0.44mm。 4.2.3 怀卵量 发育成熟的亲虾在水温升至26℃左右开始产卵,为多次产卵。雌虾怀卵量20×104粒~ 50×104粒。 5 遗传学特性 5.1 染色体数目 日本对虾的染色体数目为2n=86。 5.2 生化遗传学特性 5.2.1 同工酶图谱 日本对虾成体肌肉中的乳酸脱氢酶(LDH)同工酶电泳图谱见图4,表现为一条酶带。 图4 日本对虾肌肉LDH同工酶电泳图谱 5.2.2 群体遗传变异范围 日本对虾平均多态位点比例为18.2%;平均杂合度的观测值为0.1042±0.0045。 6 检测方法 6.1 染色体的检测 6.1.1 染色体的制备 6.1.1.1 日本对虾胚胎或幼体放入含0.02%秋水仙素的海水中培养3h~4h。 6.1.1.2 移去海水,加入0.075mol/L氯化钾溶液中室温下处理20min~30min。 3GB/T26621—2011 6.1.1.3 移去低渗溶液,加入预冷的现配卡诺(Carnoy)氏固定液(甲醇∶冰乙酸=3∶1)固定,每隔 15min更换一次固定液,更换2次~3次,最后更换1∶1的Carnoy氏固定液固定30min。 6.1.1.4 将胚胎或幼体滴到冰冻的载玻片上,室温下干燥。 6.1.1.5 用磷酸缓冲液(0.1mol/L,pH7.2)将吉姆萨(Giemsa)原液稀释为4%的溶液染色15min。 吉姆萨染色液的配制见附录A。 6.1.2 染色体观察 选择染色体形态好的分裂相100个计数,确定染色体数目。 6.2 同工酶检测 6.2.1 样品的采集与保存 日本对虾成体(活体)运到实验室,保存于-70℃超低温冰箱中。 6.2.2 样品制备 从液氮中分别取出样品(肌肉),加入5倍体积的0.1mol/L磷酸缓冲液(PBS)后冰浴匀浆,4℃离 心(15000r/min,10min),取上清液加入少量1%溴酚兰,再加入等体积的40%蔗糖溶液。-20℃保 存待测。 6.2.3 电泳 同工酶电泳采用不连续聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳。电泳在4℃冰箱中进行。电泳参数如下。 凝胶浓度(T):T浓缩胶=3.0%(pH6.7),T分离胶=7.5%(pH8.9)。 乳酸脱氢酶染色液配方见附录B。 6.2.4 结果计算 多态位点比例按式(3)计算: P=N1/N2×100% …………………………(3) 式中: P———多态位点比例; N1———多态位点数; N2———观察位点总数。 平均杂合度观察值按式(4)计算: Ho=H1/N …………………………(4) 式中: Ho———平均杂合度观察值; H1———观察到的杂合个体数; N———观察的个体总数。 7 判定规则 检测结果不符合第3章和5.1要求的,则判定为不合格项;有不合格项的样品为不合格样品。合格 样品数与样品总数的比为合格率。 4GB/T26621—2011 附 录 A (规范性附录) 吉姆萨(Giemsa)染色液的配制 A.1 Giemsa染色液母液 称取0.5gGiemsa粉,量取甘油33mL,在研钵中先用少量甘油与Giemsa粉混合,研磨至无颗粒 时再将剩余甘油加入,在56℃条件下温浴2h后,加入33mL甲醇,混匀。并保存于棕色瓶中备用。 A.2 磷酸缓冲液(0.2mol/L,pH7.2) 磷酸缓冲液由A液和B液按比例混合而成。 A.2.1 A液(0.2mol/L,Na2HPO4) 取36.1g磷酸氢二钠(Na2HPO4·H2O)定容于1000mL的蒸馏水中;或取71.63g磷酸氢二钠 (Na2HPO4·2H2O)定容于1000mL的蒸馏水中,即可。 A.2.2 B液(0.2mol/L,NaH2PO4) 取27.6g磷酸二氢钠(NaH2PO4·H2O)定容于1000mL的蒸馏水中;或取31.21g磷酸二氢钠 (NaH2PO4·2H2O)定容于1000mL的蒸馏水中,即可。 A.2.3 取A液720mL、B液28mL,两者混合即可。 A.3 Giemsa染色液 取100mL的磷酸缓冲液,加入4mLGiemsa染色原液即可。 5GB/T26621—2011 附 录 B (规范性附录) 同工酶染色液及其所需溶液的配制 B.1 1mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液的配制 800mL水中加入121.1gTris碱,加入浓HCl调节pH至8.0,加水定容至1000mL,分装后高压 灭菌。 B.2 同工酶染色液的配制 见表B.1。 表B.1 同工酶染色液的配制 药 品 浓 度 剂量/mL Tris-HCl 0.2mol/L(pH8.0) 50 乳酸锂 1.0mol/L(pH8.0) 8 辅酶Ⅰ(NAD) 10mg/mL 1 硝基四唑蓝(NBT) 5mg/mL 1 甲基吩嗪甲基硫酸盐(PMS) 5mg/mL 1 6GB/T26621—2011