书 书 书犐犆犛 １１ ． ２２０ 犅 ４１ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２２３２９ — ２００８ 牛皮蝇蛆病诊断技术 犇犻犪犵狀狅狊狋犻犮狋犲犮犺狀犻狇狌犲狊犳狅狉犫狅狏犻狀犲犺狔狆狅犱犲狉犿狅狊犻狊 ２００８  ０８  ２２ 发布 ２００８  １２  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准的附录 Ａ 、 附录 Ｂ 和附录 Ｃ 均为规范性附录 。 本标准由中华人民共和国农业部提出 。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口 。 本标准起草单位 ： 中国农业科学院兰州兽医研究所 。 本标准主要起草人 ： 殷宏 、 罗建勋 、 关贵全 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２２３２９ — ２００８ 牛皮蝇蛆病诊断技术 １ 　 范围 本标准规定了牛皮蝇蛆病 （ ｂｏｖｉｎｅｈｙｐｏｄｅｒｍｏｓｉｓ ） 诊断技术的要求 ， 包括临床诊断 、 动物剖检和酶联 免疫吸附试验 （ ＥＬＩＳＡ ）。 本标准适用于牛皮蝇蛆病的诊断 。 ２ 　 临床诊断及剖检检查 ２ ． １ 　 临床诊断 牛感染皮蝇后 ， 一般不呈现明显的临床症状 ， 但严重感染时 ， 幼畜可表现出消瘦 、 生长缓慢 、 贫血 ， 母 牛产乳量下降 ， 役畜的使役能力降低等症状 。 当皮蝇幼虫钻入脑部时 ， 可引起神经症状 ， 如作后退运动 、 突然倒地 、 麻痹或晕厥等 ， 重者可造成死亡 。 此外 ， 由于第三期幼虫在皮肤上形成穿孔 ， 细菌感染而引起 化脓 ， 形成瘘管 ， 常有脓液和浆液流出 ， 瘘管逐渐愈合 ， 形成斑痕 。 但上述症状只能作为诊断的参考指 标 ， 不能作为确诊的依据 。 只有当在牛的背部发现瘤肿状隆起和皮下蜂窝组织炎 ， 且可挤出第三期幼虫 时 ， 方能确诊 。 ２ ． ２ 　 剖检检查 当对疫区开展流行病学调查时 ， 经常采用此方法 。 重点检查部位为食道黏膜 、 背部皮下 、 瘤胃浆膜 、 大网膜 、 食道浆膜等部位 ， 如发现第一期 、 第二期或第三期任一阶段的幼虫 ， 便可确诊 。 ２ ． ２ ． １ 　 第一期幼虫的形态 呈乳白色 ， 长 ３．５ｍｍ ～ １２ｍｍ ， 宽 ０．７５ｍｍ ～ ２ｍｍ ， 前端稍尖 。 ２ ． ２ ． ２ 　 第二期幼虫的形态 呈浅黄白色 ， 长 １１ｍｍ ～ １５ｍｍ ， 宽 ３ｍｍ ～ ６ｍｍ 。 腹面微隆 ， 背面平 。 外观口钩仅见两个黄褐色 的小圆点 ， 彼此分离 。 ２ ． ２ ． ３ 　 第三期幼虫的形态 虫体长 １９ｍｍ ～ ２５ｍｍ ， 宽 ８ｍｍ ～ １１ｍｍ ， 长宽比例 （ ２．３ ～ ２．１ ） ∶１ ， 背面平 ， 腹面隆起 ， 侧面有疣 状突 ， 色泽因成熟程度不同而异 ， 由淡黄白至淡褐色 、 黄褐色以至黑色 ， 体具 １１ 节 （ 胸部 ３ 节 、 腹部 ８ 节 ）， 伪头部具一对头感器 ， 彼此分离 。 口钩退化为黑色圆点 。 ３ 　 酶联免疫吸附试验 （ 犲狀狕狔犿犲犾犻狀犽犲犱犻犿犿狌狀狅狊狅狉犫犲狀狋犪狊狊犪狔 ； 犈犔犐犛犃 ） ３ ． １ 　 试验材料 ３ ． １ ． １ 　 抗原 制备方法见附录 Ａ 。 ３ ． １ ． ２ 　 标准阳性血清 自牛皮蝇蛆病流行区颈静脉采集背部有瘤包牛的血液 ， 分离血清 ， 经国外商品化试剂盒检测为阳性 后 ， 按 ３∶１ （ ３ 体积血清 ∶１ 体积甘油 ） 加入甘油 ， 混匀 ， 分装于 １．５ｍＬ 离心管 ， －２０℃ 保存备用 。 ３ ． １ ． ３ 　 标准阴性血清 自无牛皮蝇蛆病流行的南方省份经颈静脉采集牛的血液 ， 分离血清 ， 经国外商品化试剂盒检测为阴 性后 ， 按 ３∶１ （ ３ 体积血清 ∶１ 体积甘油 ） 加入甘油 ， 混匀 ， 分装于 １．５ｍＬ 离心管 ， －２０℃ 保存备用 。 ３ ． １ ． ４ 　 酶标记二抗 辣根过氧化物标记的兔抗牛 ＩｇＧ ， 自生化试剂公司购买 。 １ 犌犅 ／ 犜 ２２３２９ — ２００８ ３ ． １ ． ５ 　 血清样品的采集和处理 颈静脉采集动物血清 ， 加叠氮化钠 （ ０．０１％ ） 或硫柳汞 （ ０．０１％ ） 进行防腐 ， ４℃ 冷藏保存 。 ３ ． １ ． ６ 　 溶液配制 自行配制 ， 配置方法见附录 Ｂ 。 ３ ． ２ 　 操作方法 ３ ． ２ ． １ 　 抗原包被 用抗原包被液将抗原按使用说明稀释至工作浓度 ； 用加样器加工作浓度抗原至 ＥＬＩＳＡ 反应板各孔 内 ， 每孔 １００ μ Ｌ ， 加盖后在 ３７℃ 温箱内孵育 １ｈ ， 然后置 ４℃ 冰箱过夜 ； 将包被液甩净 ， 用洗涤液在洗板 机上按 ３×３００ μ Ｌ 程序 ， 或用洗瓶重复洗涤 ５ 次 。 ３ ． ２ ． ２ 　 封闭 每孔加入封闭液 ２００ μ Ｌ ， ３７℃ 温箱内孵育 ３０ｍｉｎ ， 甩干 ， 按 ３．２．１ 方法洗涤 。 ３ ． ２ ． ３ 　 血清稀释 用血清稀释液将待检血清和标准血清作 １∶２００ 稀释 。 ３ ． ２ ． ４ 　 加样 按照附录 Ｃ 格式每孔加 １００ μ Ｌ 待检血清 ， 试验要同时设空白对照 、 酶标记二抗对照 、 标准阳性血 清对照和标准阴性血清对照 。 空白对照孔 （ Ａ１ ， Ａ２ ， Ｂ１ ， Ｂ２ ） 和酶标记二抗对照孔 （ Ｃ１ ， Ｃ２ ， Ｄ１ ， Ｄ２ ） 各加 １００ μ Ｌ 血清稀释液 ， 加盖后 ３７℃ 温箱内孵育 １ｈ 。 用 ３．２．１ 方法进行洗涤 。 ３ ． ２ ． ５ 　 加酶标记二抗 按说明书用洗涤液将酶标记二抗稀释至工作浓度 ， 每孔加入 １００ μ Ｌ ， 但空白对照孔只加相应稀释 液 ， 加盖后于 ３７℃ 温箱内孵育 １ｈ 。 用 ３．２．１ 方法进行洗涤 。 ３ ． ２ ． ６ 　 加底物 每孔加入现配制的底物溶液 １００ μ Ｌ ， 加盖后于 ３７℃ 避光温箱内孵育 ４０ｍｉｎ 。 ３ ． ３ 　 判定 ３ ． ３ ． １ 　 酶联免疫检测仪测定 用空白对照调零 ， 在 ４０５ｎｍ 波长处 ， 测定每孔的光吸收值 （ ＯＤ 值 ）， 分别计算出每份被检样品孔 、 标准阳性孔和标准阴性孔的平均 ＯＤ 值 。 在 犘 ／ 犖 值 （ 犘 为标准阳性血清的平均 ＯＤ 值 ， 犖 为标准阴性 血清的平均 ＯＤ 值 ） 大于 ２ 时 ， 测定结果方为有效 。 否则 ， 应查明原因 ， 重做 。 ３ ． ３ ． ２ 　 结果判定 ３ ． ３ ． ２ ． １ 　 当结果有效时 ， 利用式 （ １ ） 求出 ＯＤ 比值 。 ＯＤ 比值 ＝ 待检血清样品平均 ＯＤ 值 － 标准阴性血清平均 ＯＤ 值 标准阳性血清平均 ＯＤ 值 － 标准阴性血清平均 ＯＤ 值 ×１００％ …………（ １ ） ３ ． ３ ． ２ ． ２ 　 ＯＤ 比值小于或等于 １５％ ， 判定为 ＥＬＩＳＡ 法阴性 （ － ）； ＯＤ 比值在 １６％ ～ ２０％ ， 判定为 ＥＬＩＳＡ 法疑似 （ ± ）； ＯＤ 比值大于或等于 ２１％ ， 判定为 ＥＬＩＳＡ 法阳性 。 疑似者复检一次 ， 仍为疑似者 判为阳性 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ２２３２９ — ２００８ 附 　 录 　 犃 （ 规范性附录 ） 抗原的制备 犃 ． １ 　 取 １００ 条新鲜采集或 －２０℃ 保存的纹皮蝇二期幼虫 ， 置于干净的 ５０ｍＬ 烧杯中 ， 用剪刀剪碎 。 犃 ． ２ 　 加入 １００ｍＬｐＨ７．２ 的磷酸盐缓冲液 （ ＰＢＳ ）， ４℃ 搅拌过夜 。 犃 ． ３ 　 第二天加入 １５．５４ｇ 硫酸铵 ， ４℃ 轻摇 ３０ｍｉｎ 。 犃 ． ４ 　 １００００ｒ ／ ｍｉｎ ， ４℃ 离心 ２０ｍｉｎ ， 丢弃沉淀 ， 收集上清液 。 犃 ． ５ 　 在上清液中加入 １５．５４ｇ 硫酸铵 ， ４℃ 轻摇 ３０ｍｉｎ ， １００００ｒ ／ ｍｉｎ ， ４℃ 离心 ２０ｍｉｎ ， 弃上清 ， 收集 沉淀 。 犃 ． ６ 　 将沉淀重溶于 ２０ｍＬｐＨ７．２ 磷酸盐缓冲液中 ， 装入透析袋 ， 于 ４℃ 在清水中搅动透析 １ｈ ， 然后换 用 ｐＨ７．２ 磷酸盐缓冲液 ， 于 ４℃ 透析过夜 。 犃 ． ７ 　 取出透析产物 ， １００００ｒ ／ ｍｉｎ ， ４℃ 离心 ５０ｍｉｎ 。 犃 ． ８ 　 收集上清 ， 用紫外分光光度计测定蛋白含量 ， 计算出抗原浓度 ， 分装于 １．５ｍＬ 离心管 ， －２０℃ 保 存备用 。 ３ 犌犅 ／ 犜 ２２３２９ — ２００８ 附 　 录 　 犅 （ 规范性附录 ） 溶 　 液 　 配 　 制 犅 ． １ 　 抗原包被液 （ 狆犎 ９ ． ６ ， ０ ． ０５ 犿狅犾 ／ 犔 碳酸盐缓冲液 ） 碳酸氢钠 （ ＮａＨＣＯ ３ ） 　　　　　　　　 ２．９３ｇ 碳酸钠 （ Ｎａ ２ ＣＯ ３ ） １．５ｇ 蒸馏水 ９００ｍＬ 用 １ｍｏｌ ／ Ｌ 的盐酸调 ｐＨ 值至 ９．６ ， 加蒸馏水至 １０００ｍＬ ， 于 ４℃ 保存备用 。 犅 ． ２ 　 洗涤液 （ ０ ． ０１ 犿狅犾 ／ 犔 ， 狆犎 ７ ． ４ 犘犅犛犜 ） 犅 ． ２ ． １ 　 磷酸盐缓冲液 （ 狆犎 ７ ． ２ ） 氯化钠 （ ＮａＣｌ ） ４０ｇ 氯化钾 （ ＫＣｌ ） １ｇ 磷酸二氢钾 （ ＫＨ ２ ＰＯ ４ ） １ｇ 磷酸氢二钠 （ Ｎａ ２ ＨＰＯ ４ · １２Ｈ ２ Ｏ ） １７．９ｇ 蒸馏水 ４．９Ｌ 用 １ｍｏｌ ／ Ｌ 的盐酸或 １ｍｏｌ ／ Ｌ 的氢氧化钠调 ｐＨ 值至 ７．２ ， 加蒸馏水至