书 书 书犐犆犛 ６５ ． １４０ 犆犆犛犅 ４７ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 １９４２７ — ２０２２ 代替 犌犅 ／ 犜 １９４２７ — ２００３ 蜂胶中 １２ 种酚类化合物含量的测定液相色谱  串联质谱法和液相色谱法 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳 １２ 狆犺犲狀狅犾犻犮犮狅犿狆狅狌狀犱狊犻狀狆狉狅狆狅犾犻狊 — 犎犘犔犆犕犛 ／ 犕犛犿犲狋犺狅犱犪狀犱犎犘犔犆犿犲狋犺狅犱 　 ２０２２  ０３  ０９ 发布 ２０２２  １０  ０１ 实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本文件按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２０２０ 《 标准化工作导则 　 第 １ 部分 ： 标准化文件的结构和起草规则 》 的规定起草 。 本文件代替 ＧＢ ／ Ｔ１９４２７ — ２００３ 《 蜂胶中芦丁 、 杨梅酮 、 槲皮素 、 莰菲醇 、 芹菜素 、 松属素 、 苛因 、 高良姜素含量的测定方法 　 液相色谱  串联质谱检测法和液相色谱  紫外检测法 》， 与 ＧＢ ／ Ｔ１９４２７ — ２００３ 相比 ， 除结构调整和编辑性修改外 ， 主要技术变化如下 ： ａ ） 　 增加了咖啡酸 、 狆  香豆酸 、 阿魏酸 、 短叶松素 ３ 乙酸酯 、 绿原酸 、 阿替匹林 Ｃ 检测项目 （ 见第 １ 章 、 ５．１１ 、 ７．２ ）； ｂ ） 　 删除了芦丁 、 杨梅酮检测项目 （ 见 ２００３ 年版的第 １ 章 ， ４．４ 、 ４．５ 、 ４．６ 、 ６．２ ）； ｃ ） 　 更改了蜂胶样品提取条件 （ 见 ７．１ ， ２００３ 年版的 ６．１ ）。 本文件由中华全国供销合作总社提出 。 本文件由全国蜂产品标准化工作组 （ ＳＡＣ ／ ＳＷＧ２ ） 归口 。 本文件起草单位 ： 秦皇岛海关技术中心 、 浙江大学 、 厦门思健生物科技有限公司 。 本文件主要起草人 ： 李学民 、 胡福良 、 崔宗岩 、 张翠平 、 李响 、 杨志伟 、 曹翠玲 、 刘晓茂 、 贾光群 、 张进杰 、 曹彦忠 、 颜鉴翔 。 本文件所代替文件的历次版本发布情况为 ： ——— ＧＢ ／ Ｔ１９４２７ — ２００３ 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 １９４２７ — ２０２２ 蜂胶中 １２ 种酚类化合物含量的测定液相色谱  串联质谱法和液相色谱法 １ 　 范围 本文件描述了蜂胶中咖啡酸 、 狆  香豆酸 、 阿魏酸 、 槲皮素 、 莰菲醇 、 芹菜素 、 松属素 、 柯因 、 高良姜素 、 短叶松素 ３ 乙酸酯 、 绿原酸 、 阿替匹林 Ｃ 含量测定的液相色谱  串联质谱法和液相色谱法 。 本文件适用于蜂胶中咖啡酸 、 狆  香豆酸 、 阿魏酸 、 槲皮素 、 莰菲醇 、 芹菜素 、 松属素 、 柯因 、 高良姜素 、 短叶松素 ３ 乙酸酯 、 绿原酸 、 阿替匹林 Ｃ 含量的测定 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。 其中 ， 注日期的引用文件 ， 仅该日期对应的版本适用于本文件 ； 不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ３ 　 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 。 ４ 　 原理 蜂胶试样用 ８５％ 乙醇水溶液提取 ， 超声 、 离心 、 过滤和定容后 ， 液相色谱  串联质谱仪测定或配有紫外检测器的液相色谱仪测定 ， 外标法定量 。 ５ 　 试剂和材料 除另有说明外 ， 所用试剂均为分析纯 ， 水为 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 规定的一级水 。 ５ ． １ 　 乙醇 ： 无水乙醇 。 ５ ． ２ 　 甲醇 ： 色谱纯 。 ５ ． ３ 　 甲酸 ： 色谱纯 。 ５ ． ４ 　 乙酸 ： 色谱纯 。 ５ ． ５ 　 乙醇水溶液 （ ８５＋１５ ）： 准确移取 ８５ｍＬ 乙醇 （ ５．１ ） 至 １００ｍＬ 容量瓶中 ， 用水定容 。 ５ ． ６ 　 甲醇水溶液 （ ８０＋２０ ）： 准确移取 ８０ｍＬ 甲醇 （ ５．２ ） 至 １００ｍＬ 容量瓶中 ， 用水定容 。 ５ ． ７ 　 甲醇 ０．１％ 甲酸水溶液 （ ５０＋５０ ）： 准确移取 ５０ｍＬ 甲醇 （ ５．２ ） 以及 ０．１ｍＬ 甲酸 （ ５．３ ） 至 １００ｍＬ 容量瓶中 ， 用水定容 。 ５ ． ８ 　 ０．１％ 甲酸水溶液 ： 准确移取 １．０ｍＬ 甲酸 （ ５．３ ） 至 １０００ｍＬ 容量瓶中 ， 用水定容 。 ５ ． ９ 　 ０．１％ 甲酸  甲醇溶液 ： 准确移取 １．０ｍＬ 甲酸 （ ５．３ ） 至 １０００ｍＬ 容量瓶中 ， 用甲醇 （ ５．２ ） 定容 。 ５ ． １０ 　 １．０％ 乙酸水溶液 ： 准确移取 １０ｍＬ 乙酸 （ ５．４ ） 至 １０００ｍＬ 容量瓶中 ， 用水定容 。 １ 犌犅 ／ 犜 １９４２７ — ２０２２ ５ ． １１ 　 标准物质 ： 绿原酸 （ ＣＡＳ 号 ： ３２７９７９ ）、 咖啡酸 （ ＣＡＳ 号 ： ３３１３９５ ）、 狆  香豆酸 （ ＣＡＳ 号 ： ５０１９８４ ）、 阿魏酸 （ ＣＡＳ 号 ： １１３５２４６ ）、 槲皮素 （ ＣＡＳ 号 ： １１７３９５ ）、 莰菲醇 （ ＣＡＳ 号 ： ５２０１８３ ）、 芹菜素 （ ＣＡＳ 号 ： ５２０３６５ ）、 松属素 （ ＣＡＳ 号 ： ４８０３９７ ）、 短叶松素 ３ 乙酸酯 （ ＣＡＳ 号 ： ５２１１７６９８ ）、 柯因 （ ＣＡＳ 号 ： ４８０４００ ）、 高良姜素 （ ＣＡＳ 号 ： ５４８８３４ ） 和阿替匹林 Ｃ （ ＣＡＳ 号 ： ７２９４４１９５ ）， 纯度均不低于 ９８％ 。 ５ ． １２ 　 标准储备液 ： 准确称取适量的标准物质 （ ５．１１ ）， 分别用甲醇 （ ５．２ ） 制备浓度为 １．０ｍｇ ／ ｍＬ 的标准储备液 ， 该储备液在 －１８℃ 及以下温度可稳定保存 ６ 个月 。 ５ ． １３ 　 标准工作溶液 ： 移取适量的标准储备液 （ ５．１２ ）， 用甲醇 ０．１％ 甲酸水溶液 （ ５．７ ） 稀释成浓度为 ０．０２ μ ｇ ／ ｍＬ 、 ０．０５ μ ｇ ／ ｍＬ 、 ０．１ μ ｇ ／ ｍＬ 、 ０．２ μ ｇ ／ ｍＬ 、 ０．５ μ ｇ ／ ｍＬ 、 １．０ μ ｇ ／ ｍＬ 的混合标准工作溶液 ， 供液相色谱  串联质谱法检测使用 ； 移取适量的标准储备液 （ ５．１２ ）， 用甲醇水溶液 （ ５．６ ） 分别稀释成浓度为 １．０ μ ｇ ／ ｍＬ 、 ２．０ μ ｇ ／ ｍＬ 、 ５．０ μ ｇ ／ ｍＬ 、 １０．０ μ ｇ ／ ｍＬ 、 ２０．０ μ ｇ ／ ｍＬ 、 ５０．０ μ ｇ ／ ｍＬ 的混合标准工作溶液 ， 供液相色谱  紫外检测法检测使用 。 ６ 　 仪器和设备 ６ ． １ 　 液相色谱  串联质谱仪 ： 配有电喷雾离子源 。 ６ ． ２ 　 液相色谱仪 ： 配有紫外 （ 或二极管阵列 ） 检测器 。 ６ ． ３ 　 分析天平 ： 感量 ０．０１ｍｇ 和 ０．００１ｇ 。 ６ ． ４ 　 超声波清洗仪 。 ６ ． ５ 　 离心机 ： 转速不低于 ４０００ｒ ／ ｍｉｎ 。 ６ ． ６ 　 微量可调移液器 ： 量程分别为 １０ μ Ｌ ～ １００ μ Ｌ 和 ０．１ｍＬ ～ １ｍＬ 。 ６ ． ７ 　 微孔滤膜 ： ０．２２ μ ｍ 。 ７ 　 分析步骤 ７ ． １ 　 试样的制备与处理 ７ ． １ ． １ 　 试样的制备 取混合均匀的代表性蜂胶样品约 １００ｇ ， 密封 ， 并做标记 。 在样品测定前 ， 将被测样品放入 １０℃ 以下冰箱中保持 ２ｈ 后 ， 取出 ２０ｇ ～ ３０ｇ ， 迅速用粉碎机粉碎 ， 过孔径约为 ２ｍｍ （ １０ 目 ） 的筛 ， 冷藏保存于冰箱中作为待测试样 。 ７ ． １ ． ２ 　 试样的处理 称取 ０．５ｇ （ 精确至 ０．００１ｇ ） 试样于 ５０ｍＬ 塑料离心管中 ， 加 １５ｍＬ 乙醇水溶液 （ ５．５ ）， 在室温超声提取 ２０ｍｉｎ ， 在 ４０００ｒ ／ ｍｉｎ 下离心 １０ｍｉｎ ， 上清液转入 ５０ｍＬ 容量瓶中 ， 按照上述步骤重复提取离心 ２ 次 ， 合并上清液 ， 用乙醇水溶液 （ ５．５ ） 定容至 ５０ｍＬ ， 混匀 。 取上述样品溶液用甲醇水溶液 （ ５．６ ） 适当稀释并混匀后 ， 取部分溶液过 ０．２２ μ ｍ 微孔滤膜 （ ６．７ ） 至样品瓶中 ， 供液相色谱仪 （ ６．２ ） 测定 ； 或取上述样品溶液用甲醇 ０．１％ 甲酸水溶液 （ ５．７ ） 适当稀释后 ， 过 ０．２２ μ ｍ 微孔滤膜 （ ６．７ ） 至样品瓶中 ， 供液相色谱  串联质谱仪 （ ６．１ ） 测定 。 ７ ． ２ 　 测定 ７ ． ２ ． １ 　 液相色谱  串联质谱参考条件 液相色谱  串联质谱仪的液相色谱参考条件如下 ： ａ ） 　 色谱柱 ： Ｃ１８ ， １００ｍｍ×２．１ｍｍ ； １．７ μ ｍ 或相当者 ； ２ 犌犅 ／ 犜 １９４２７ — ２０２２ ｂ ） 　 流动相 Ａ ： ０．１％ 甲酸水溶液 （ ５．８ ）； ｃ ） 　 流动相 Ｂ ： ０．１％ 甲酸  甲醇溶液 （ ５．９ ）， 梯度洗脱条件参见附录 Ａ 的表 Ａ．１ ； ｄ ） 　 流速 ： ０．２５ｍＬ ／ ｍｉｎ ； ｅ ） 　 柱温 ：