ICS65.120 B46 中华人民共和国国家标准 GB/T17818—2010 代替GB/T17818—1999 饲 料中维生素D3的测定 高效液相色谱法 DeterminationofvitaminD3infeeds— High-performanceliquidchromatography 2010-09-26发布 2011-01-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准代替GB/T17818—1999《饲料中维生素D3的测定 高效液相色谱法》。 本标准与GB/T17818—1999主要差异如下: ———增加资料性附录A; ———原标准方法为第一法皂化提取法; ———补充第二法直接提取法,适用于维生素预混料中维生素D3的测定。 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)提出并归口。 本标准起草单位:中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所[国家饲料质量监督检验中心 (北京)]、北京桑普生物化学技术有限公司、广东爱保农科技有限公司、帝斯曼维生素(上海)有限公司、 拜耳(四川)动物保健有限公司。 本标准主要起草人:赵小阳、施文娟、虞哲高、吴革华、李俊玲、李永才、张进、商军、郑秋峰。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为: ———GB/T17818—1999。 ⅠGB/T17818—2010 饲料中维生素D3的测定 高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了饲料中维生素D3的高效液相色谱法测定。 本标准第一法适用于配合饲料、浓缩饲料、复合预混合饲料、维生素预混合饲料中维生素D3的测 定,定量限为12.5μg/kg(500IU/kg)。 本标准第二法适用于维生素预混合饲料中维生素D3的测定,定量限为125mg/kg(5×106IU/kg)。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。 GB/T603 化学试剂 试验方法中所用制剂及制品的制备 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1 饲料 采样 GB/T20195 动物饲料 试样的制备 3 第一法 皂化提取法 3.1 原理 用碱溶液皂化试样,乙醚提取维生素D3,蒸发乙醚,残渣溶解于甲醇并将部分溶液注入高效液相色 谱反相净化柱,收集含维生素D3淋洗液,蒸发至干,溶解于适当溶剂中,注入高效液相色谱分析柱,在 264nm处测定,外标法计算维生素D3含量。 3.2 试剂和溶液 除特殊注明外,本标准所用试剂均为分析纯,水符合GB/T6682中三级用水规定,色谱用水符合 GB/T6682中一级用水规定,溶液按照GB/T603配制。 3.2.1 无水乙醚(不含过氧化物) 3.2.1.1 过氧化物检查方法:用5mL乙醚加1mL碘化钾溶液(3.2.9),振摇1min,如有过氧化物则 放出游离碘,水层呈黄色,或加淀粉指示液(3.2.10),水层呈蓝色。该乙醚需处理后使用。 3.2.1.2 去除过氧化物的方法:乙醚用硫代硫酸钠溶液(3.2.11)振摇,静置,分取乙醚层,再用水振摇, 洗涤两次,重蒸,弃去首尾5%部分,收集馏出的乙醚,再检查过氧化物,应符合规定。 3.2.2 无水乙醇。 3.2.3 正己烷:色谱纯。 3.2.4 1,4-二氧六环。 3.2.5 甲醇:色谱纯。 3.2.6 2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)。 3.2.7 无水硫酸钠。 3.2.8 氮气(纯度99.9%)。 3.2.9 碘化钾溶液:100g/L。 1GB/T17818—2010 3.2.10 淀粉指示液:5g/L(临用现配)。 3.2.11 硫代硫酸钠溶液:50g/L。 3.2.12 氢氧化钾溶液:500g/L。 3.2.13 L-抗坏血酸乙醇溶液:5g/L,取0.5gL-抗坏血酸结晶纯品溶解于4mL温热的水中,用无水 乙醇(3.2.2)稀释至100mL,临用前配制。 3.2.14 酚酞指示剂:10g/L。 3.2.15 氯化钠溶液:100g/L。 3.2.16 维生素D3标准品:维生素D3含量≥99.0%。 3.2.17 维生素D3标准贮备液:称取50mg维生素D3(胆钙化醇)标准品(3.2.16)(精确至0.00001g) 于50mL棕色容量瓶中,用正己烷溶解并稀释至刻度,混匀,4℃保存。该贮备液浓度为1.0mg/mL。 3.2.18 维生素D3标准工作液:准确吸取维生素D3标准贮备液(3.2.17),用正己烷(3.2.3)按1∶100 比例稀释,若用反相色谱测定,将1.0mL维生素D3标准贮备液置入10mL棕色容量瓶中,用氮气吹 干,用甲醇(3.2.5)稀释至刻度,混匀,再按比例稀释,该标准工作液浓度为10μg/mL。 3.3 仪器和设备 3.3.1 分析天平,感量0.001g。 3.3.2 分析天平,感量0.0001g。 3.3.3 分析天平,感量0.00001g。 3.3.4 圆底烧瓶,带回流冷凝器。 3.3.5 恒温水浴或电热套。 3.3.6 旋转蒸发器。 3.3.7 超纯水器。 3.3.8 高效液相色谱仪,带紫外可调波长检测器(或二极管矩阵检测器)。 3.4 采样 按照GB/T14699.1的规定执行。 3.5 试样制备 按照GB/T20195制备试样,磨碎,全部通过0.28mm孔筛,混匀,装入密闭容器中,避光低温保存 备用。 3.6 分析步骤 3.6.1 试样溶液的制备 3.6.1.1 皂化 称取试样,配合饲料10g~20g,浓缩饲料10g,精确至0.001g,维生素预混合饲料或复合预混合 饲料1g~5g,精确至0.0001g,置入250mL圆底烧瓶中,加50mL~60mLL-抗坏血酸乙醇溶液 (3.2.13),使试样完全分散、浸湿,加10mL氢氧化钾溶液(3.2.12),混合均匀,置于沸水浴上回流 30min,不时振荡防止试样粘附在瓶壁上,皂化结束,分别用5mL无水乙醇(3.2.2)、5mL水自冷凝管 顶端冲洗其内部,取出烧瓶冷却至约40℃。 3.6.1.2 提取 定量转移全部皂化液于盛有100mL无水乙醚(3.2.1)的500mL分液漏斗中,用30mL~50mL 水分2次~3次冲洗圆底烧瓶并入分液漏斗,加盖、放气、随后混合,激烈振荡2min,静置分层。转移水 相于第二个分液漏斗中,分次用100mL、60mL乙醚重复提取两次,弃去水相,合并三次乙醚相。用氯 化钠溶液(3.2.15)100mL洗涤一次,再用水每次100mL洗涤乙醚提取液至中性,初次水洗时轻轻旋 摇,防止乳化。乙醚提取液通过无水硫酸钠(3.2.7)脱水,转移到250mL棕色容量瓶中,加100mg BHT(3.2.6)使之溶解,用乙醚定容至刻度(V1)。以上操作均在避光通风柜内进行。 2GB/T17818—2010 3.6.1.3 浓缩 从乙醚提取液(V1)中分取一定体积(V2)(依据样品标示量、称样量和提取液量确定分取量)置于旋 转蒸发器烧瓶中,在部分真空,水浴温度50℃的条件下蒸发至干,或用氮气吹干。残渣用正己烷(3.2.3) 溶解(需净化时用甲醇溶解,按3.6.1.4进行),并稀释至10mL(V3)使其获得的溶液中每毫升含维生 素D32μg~10μg(80IU~400IU),离心或通过0.45μm过滤膜过滤,收集清液移入2mL小试管,用 于高效液相色谱仪分析。以上操作均在避光通风柜内进行。 3.6.1.4 高效液相色谱净化柱净化 用5mL甲醇(3.2.5)溶解圆底烧瓶中的残渣,向高效液相色谱净化柱中注射0.5mL甲醇溶液(按 3.6.2.1所述色谱条件,以维生素D3标准甲醇溶液流出时间±0.5min)收集含维生素D3的馏分于 50mL小容量瓶中,蒸发至干(或用氮气吹干),溶解于正己烷中。 所测样品的维生素D3标示量在每千克超过10000IU范围时,可以不使用高效液相色谱净化柱, 直接用分析柱分析。 3.6.2 测定 3.6.2.1 高效液相色谱净化条件 色谱净化柱:LichrosorbRP-8,长25cm,内径10mm,粒度10μm。 流动相:甲醇+水(90+10)。 流速:2.0mL/min。 温度:室温。 检测波长:264nm。 3.6.2.2 高效液相色谱分析条件 3.6.2.2.1 正相色谱 色谱柱:硅胶Si60,长125mm,内径4.6mm,粒度5μm(或性能类似的分析柱)。 流动相:正己烷+1,4二氧六环(93+7)。 流速:1.0mL/min。 温度:室温。 进样量:20μL。 检测波长:264nm。 3.6.2.2.2 反相色谱 色谱柱:C18型柱,长125mm,内径4.6mm,粒度5μm(或性能类似的分析柱)。 流动相:甲醇+水(95+5)。 流速:1.0mL/min。 温度:室温。 进样量:20μL。 检测波长:264nm。 3.6.2.3 定量测定 按高效液相色谱仪说明书调整仪器操作参数,为准确测量按要求对分析柱进行系统适应性试验,使 维生素D3与维生素D3原或其他峰之间有较好分离度,其R≥1.5。向色谱柱注入相应的维生素D3标 准工作液(3.2.18)和试样溶液(3.6.1),得到色谱峰面积响应值,用外标法定量测定。 3.6.2.4 结果计算 3.6.2.4.1 试样中维生素D3的含量,以质量分数X1计,数值以国际单位每千克(IU/kg)或毫克每千 克(mg/kg)表示,按式(1)