中华人民共和国国家标准 生物尿中1-羟基芪的测定 高效液相色谱（HPLC）法 GB/T16156-1996 Biomaterials-Determination of urinary1-hydroxypyrene High performance liquid chromatography 本标准规定了测定尿中1-羟基的高效液相色谱法。 1-羟基芪是芪的代谢产物，尿中1-羟基芪的浓度可以反映人体接触环境中多环芳烃的水平，它不仅 与环境空气中芪的浓度有良好的正相关，而且也与苯并（a）芪有很好的正相关，因此人尿中1-羟基芪是 多环芳烃的一个灵敏有效的生物监测指标。 适用范围 本方法适用于尿中1-羟基的测定。当尿样体积为10ml时，方法检测限为0.05μg/L。 2原理 用β-葡萄糖苷酸酶将尿样中结合态的1-羟基花水解成游离态，通过C12固相富集预分离小柱、甲醇洗 脱、反相高效液相色谱柱分离、在激发波发345nm、发射波长388nm处荧光检测测量峰面积，外标法 定量。 3试剂与材料 OH 3.11-羟基芪（1-Hydroxypyrene ）含量大于96%。 （3.4）中，再以甲醇定容至100ml于4℃冰箱中冷藏。 3.3标准工作溶液：根据仪器灵敏度及线性范围将1-羟基标准储备液（3.2），用甲醇（3.4）稀释其 浓度为0.1~0.5ng的标准工作溶液。 3.4甲醇：分析纯，在测定条件下无干扰峰。 3.5重蒸水：用电渗析水或蒸馏水加高锰酸钾在碱性条件下重蒸。在测定条件下无干扰峰。 3.7 β-葡萄糖苷酸酶：反应条件为pH5。 3.8C12固相富集予分离小柱。 4仪器 4.1高效液相色谱仪：带荧光检测器。 4.1.1恒流梯度泵系统。 4.1.2 反相柱：填料为YWG-CH5μODS，柱长250mm，内径4.6mm。 国家环境保护局1996-03-06批准 1996-10-01实施 836 GB/T161561996 4.2恒温水浴。 4.3K-D浓缩装置。 4.4磁力恒温搅拌器。 4.5玻璃注射器：10及50ml。 4.6锥形瓶：100ml。 4.7移液管：1、2、5及10ml。 4.8容量瓶、烧杯、量筒、试剂瓶等。 4.9采样瓶：60ml带盖塑料瓶。 4.10冰箱。 5样品 5.1样品的性质。 5.1.1样品名称：尿样。 5.1.2样品状态：液体。 5.1.3样品稳定性：需冰冻保存，可保持三个月。 52尿样采集和储备方法：收集样品约45ml，于采样瓶（4.9）中立即送实验室冰箱中冰冻。 5.3尿样的预处理 5.3.1尿样的酶水解：用移液管准确吸取10.0ml尿样于100ml锥形瓶中，加入5ml缓冲液（3.6）。根 据产品（3.7）中的酶活性加人适量β-葡萄糖苷酸酶，使此缓冲液中含有2000单位的β-葡萄糖苷酸酶 （含酶缓冲液用前临时配制）。在37℃水浴中放置1h。 5.3.2预分离 5.3.2.1C18固相富集予分离小柱的活化：用10ml注射器（4.5）以5ml甲醇（3.4）通过小柱（3.8）， 再用10ml水（3.5）淋洗。 5.3.2.2尿样中1-羟基芘的富集：经酶水解的尿样（5.3.1）在50ml注射器（4.5）中以大约10ml/min 的速度通过活化好的固相富集予分离小柱（5.3.2.1），再用8ml甲醇（3.4）淋洗，收集甲醇淋洗液。 5.3.3浓缩定容：甲醇淋洗液（5.3.2.2）在K-D浓缩瓶（4.3）中60℃以下减压浓缩，定容至1.0（或 0.5）ml，供HPLC分析。 6操作步骤 6.1调整仪器：设置高效液相色谱仪参数，使其达到预期的分离效果，预运转至获得稳定的基线。 6.1.1柱温：室温。 6.1.2流动相组成： A液：水（3.5）+甲醇（3.4）（6+4）。 B液：甲醇（3.4）。 6.1.3洗脱：用梯度洗脱，前5min用90%A液洗脱，至10min时改变用90%B液洗脱，再保持15min。 出峰完全后用90%A液洗脱，保持15min，使流动相组成恒定，为下一次进样准备好条件。 6.1.4流动相流速：0.5ml/min 6.1.5荧光检测器条件：入ex=345nm入m=388nm，激发波长的狭缝带宽为发射波长狭缝带宽的4倍。 6.1.6色谱数据处理机或记录仪：根据样品中1-羟基芪的含量调节放大挡和纸速，以获得满意的谱图。 6.2校准 837