ICS 67.060 B21 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB 37/T 3104—2018 向日葵杂交种品种纯度 SSR 分子检测标准 The variety purity identification technique of sunflower seeds with SSR 2018 - 02 - 02 发布 山东省质量技术监督局 2018 - 03 - 02 实施 发 布 DB37/T 3104—2018 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由山东省农业厅提出。 本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位:山东农业大学、北京德农种业有限公司。 本标准起草人：张春庆、赵洪春、郑建鹏、温大兴、李岩。 本标准为首次发布。 I DB37/T 3104—2018 向日葵杂交种品种纯度 SSR 分子检测标准 1 范围 本规程规定了SSR分子检测向日葵种子纯度的试剂配比、DNA提取、SSR引物选择、多重PCR方法、PCR 产物检测等技术要求。 本规程适用于向日葵品种和杂交种种子纯度的室内快速鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 3543 种子检验技术规程 GB 20464 农作物种子标签通则 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 杂交种 各种直接用于生产的杂交向日葵一代种子。 3.2 品种纯度 品种在特征特性方面典型一致的程度，用本品种的种子数占供检本作物样品种子数的百分率表示。 3.3 标准样品 能够充分代表种或品种特征特性的种子样品，或具备指定特征、特性样品。 3.4 引物 一条互补结合在模板DNA链上的短单链，能提供3’-OH末端作为DNA合成的起始点，延伸合成模板DNA 的互补链。 4 原理 1 DB37/T 3104—2018 从向日葵种子中提取DNA，利用SSR引物进行PCR扩增，不同碱基长度的PCR扩增引物通过聚丙烯酰胺 凝胶电泳分离，并通过染色显示DNA指纹谱带类型。不同向日葵品种由于遗传组成不同，基因组中DNA 简单重复序列的重复次数有差异，这种差异可通过PCR扩增、电泳、染色程序获得的DNA指纹图谱加以区 分，从而对不同品种进行鉴定。杂交种纯度鉴定时，可从附表中选取亲本有差异的SSR引物。品种纯度 鉴定时，从附表中选择生产上常用品种间有差异的引物。 5 仪器与试剂 5.1 仪器 电子天平，水平摇床，双垂直板电泳槽，PCR仪，电泳仪，高压灭菌锅，观片灯。 5.2 试剂 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、谷氨酸、乙二胺四乙酸二钠、硼酸、过硫酸铵、四甲基乙二胺（TEMED）、 氢氧化钠、氢氧化钾、甲醛、2× Power Taq PCR Master Mix、超纯水、SSR引物、硝酸银（所用试剂 均为分析纯，所用水均为去离子水)。 6 溶液 6.1 提取液 称取0.56 g氢氧化钾于100 mL烧杯中，加去离子水溶解并定容至100 mL，4 ℃贮存备用。 6.2 30% 凝胶溶液 称取292 g丙烯酰胺于1000 mL烧杯中，加去离子水溶解，再加入8 g甲叉双丙烯酰胺，溶解后定容 至1000 mL，4 ℃贮存备用。 6.3 5×TBE 称取54 gTris、3.72 g乙二胺四乙酸二钠、27.5 g硼酸于1000 mL烧杯中，溶解后定容至1000mL。 6.4 催化剂 称取10 g过硫酸胺于100 mL烧杯中，加去离子水溶解并定容至100 mL，4 ℃贮存备用。 6.5 电极缓冲液 取5×TBE 200 mL，用去离子水定容至1000 mL。 6.6 染色液 称取1 g硝酸银溶于500 mL去离子水中。 6.7 显色液 称取10 g氢氧化钠溶于500 mL去离子水中，用时加2 mL甲醛。 7 操作程序 2 DB37/T 3104—2018 7.1 DNA 提取 从送验样品中随机数取向日葵种子200 粒，将种子剥壳后纵切，放入1.5 mL离心管中，加入300 μL 提取液，提取时间1 min～24 h均可，使用前混匀、静止5 分钟、离心3000 rpm，0.5 min，取上清即为 DNA样品，用于PCR扩增时DNA样品模板量为2 μL。 7.2 扩增体系 采用20 μL扩增体系，其中每对U-primers的上下游引物(10 μM )各0.5 μL，2 μL25mmol/L MgCl 2 ， 0.2 μL5U/μL Taq酶，2 μL10× PCR Buffer，2 μL DNA提取液，用灭菌后的超纯水补足20 μL。 7.3 多重 PCR 扩增程序 通用多重PCR扩增程序采用“两段循环模式”： a) 预变性(94 ℃，5 min)； b) 第一段循环(循环数：3)命名为“逐一退火循环”：变性(94 ℃，40 s)；按照未加通用接头前 的多对引物的退火温度从高到低的顺序逐一退火，每个退火温度的退火时间为 20 s；延伸 (72 ℃，30 s)； c) 第二段循环(循环数：28～32，通常为 30 个循环)：变性(94 ℃，40 s)；将退火和延伸过程合 并(70 ℃，50 s)； d) 终延伸(72 ℃，10 min)。引物选择参考附表，每个杂交种选择 3～5 对亲本有差异的引物扩增。 7.4 扩增产物检测 可用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，也可用高通量检测设备，对PCR产物进行检测。聚丙烯酰胺凝胶电 泳检测程序如下。 7.4.1 凝胶制备 将洗净晾干的玻璃板采用水平平板灌胶的方式组装玻璃板，用铁夹固定，取20 mL 5×TBE，30 mL 30 %Acr，50 mL去离子水于烧杯中，加800 uL～1000 uL的10 % APS，80 uL～100 uL TEMED 混匀，灌 入板中，插入梳子，10 min左右聚合，拔出梳子，吸取多余的水，装板。 7.4.2 点样 用微量移液器取2 ul体系加入样品槽，每加一个样品后，清洗移液器两次，区分不同引物加marker。 7.4.3 电泳 加样完毕后，加入电极缓冲液，上槽电极缓冲液要没过矮玻璃板，下槽电极缓冲液要没过玻璃板， 将电源线正极接下槽，负极接上槽。接通电源，180 V稳压电泳2.5 h。 7.4.4 卸板、染色、显色 倒出电极液，卸开电泳槽并用油灰刀取出胶片，将胶放入去离子水中水平摇床1 min，倒掉去离子 水，加入染色液硝酸银，水平摇床2 min～3 min，倒掉，加入去离子，水水平摇床1 min，倒掉，加入 显色液500 ml（2 %氢氧化钠，用时加入甲醛2 ml），水平摇床至显色为止，倒掉显色液，加入去离子 水水平摇床1 min。 7.4.5 谱带分析 3 DB37/T 3104—2018 待整个供检样品电泳结束后，鉴定凝胶胶片上电泳谱带的一致性。对检测的SSR引物双亲谱带同时 出现的为本品种，只有某一亲本谱带为亲本，谱带与双亲位置有差异的籽粒为杂粒。 8 结果计算 计数供检样品粒数（N）和非本品种粒数（M），并按式计算电泳测定值X%（保留一位小数）。 X（%）=（N - M）/ N×100 9 结果报告 按照GB/T 3543，写明对照样品名称，使用的亲本有差异的引物数量，检测粒数，纯度%。对送样样 品的检验需注明：“结果仅对样品负责”；监督检验时，需注明：“结果对种子批负责”。 4 DB37/T 3104—2018 AA 附 录 A （规范性附录） 引物及其参数 表A.1规定了标准中引物及其参数。 表A.1 引物及其参数 引物名称 序列(5'to3') Tm ORS928-F CATGGTTATTTTGGTTTGGGTTT 54.8 ORS928-R GCTATTATCATGTCCTTGTCCTTTT 57.1 ORS613-F GTAAACCCTAGGTCAATTTGCAG 58.4 ORS613-R ATCTCCGGAAAACATTCTCG 55.8 ORS543-F CCAAGTTTCAGTTACAATCCATGA 56.8 ORS543-R GGTCATTAGGAGTTTGGGATCA 58.2 ORS694-F CCTGGAACTGAACCGAGAAC 59.8 ORS694-R GCCGTGAAACAGAGAGAGGA 59.8 ORS956-F GGACCAGATTGCTTCCTAGACTT 60.2 ORS956-R TCAACATGCGTGATTATTGTTTG 54.8 ORS483-F CCGAACAACAATCTCCACAA 55.8 ORS483-R GGTTTAGGTGTCGCATCACA 57.8 ORS925-F ATGATTCTAAGTTGCGGTAGTGC 58.4 ORS925-R GTTGGGTTTAAGTTGTTGCTTCC 58.4 ORS1025-F GACATGGCTTGAACATTTGATTA 54.8 ORS1025-R TCTTATATGCACATCAGTACAAGTCTC 59.0 ORS1021-F AACCCTAATCCAACCAGATACGA 58.4 ORS1021-R TACCACCAGCTCATCCTTAACCT 60.2 ORS1079-F TACGACTGACGATTCCATTTCTC 58.4 ORS1079-R AACTGGATTTCACAGGGAGTGTT 58.4 ORS1256-F GATGTTGATGTTGGTGAAGTTGC 58.4 ORS1256-R CTCCGTCACCTTAAGCACTTGTA 60.2 ORS409-F TCCCAGACTAGAGATCGACCA 60.0 ORS409-R AAACTCAAGGGACTAAGGTTGC 58.2 ORS1108-F ACCACACTTATCCAAAGGTTTAAGG 58.7 ORS1108-R CGTGAGAGTAGTTACGAGAAGGAGA 62.0 退火温度 54 55(+2、+1) 56 59(-1、+1、+2) 54 55 57 54 57 57 57 57 58（-1） 5 DB37/T 3104—2018 表A.1 引物及其参数 (续) 引物名称 序列(5'to3') Tm ORS727-F GGTGGCAAGTGGTGGTTAGA 59.8 ORS727-R AAAGCTGGTCATCTCAAGGGTA 58.2