(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210997990.5 (22)申请日 2022.08.19 (71)申请人 山东大学 地址 266237 山东省青岛市 即墨滨海路72 号 (72)发明人 谷立川　王茂凤　张坤迪　许素娟　 (74)专利代理 机构 济南圣达知识产权代理有限 公司 372 21 专利代理师 李健康 (51)Int.Cl. C07K 14/165(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01)A61K 39/215(2006.01) A61P 31/14(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种降低蛋白质变性温度的方法及其突变 体与应用 (57)摘要 本发明公开了一种降低蛋白质变性温度的 方法， 并得到变性温度降低的突变体， 其可用其 制备一种减毒活疫苗。 本发明通过对已有蛋白质 结构进行分析， 选择结构 核的色氨 酸等大侧链氨 基酸， 分析其密码子碱基组成， 突变为2 ‑3个不同 碱基组成密码子的氨基酸， 保证回复突变概率 低。 突变蛋白质的结构核出现空洞， 改变了其热 稳定性。 利用蛋白质变性 温度降低的突变体或其 组合， 本发明对其进行反向遗传学操作， 挑选出 在鼻腔或上呼吸道存活而不能在体内存活的突 变体， 以达到构建减毒活疫苗的目的。 本发明方 法与传统减毒活疫苗比， 无需传代， 开发时间短， 并且制得的减毒活疫苗无需注射， 鼻腔吸入即 可， 在病原减 毒活疫苗制备 领域极具应用前 景。 权利要求书3页 说明书17页 附图3页 CN 115353552 A 2022.11.18 CN 115353552 A 1.一种降低蛋白质变性温度的方法， 步骤是： (1)分析和选择蛋白质单个结构域的突变氨基酸位点， 对网址为https:// www1.rcsb.org的PDB数据库公开的相关蛋白质结构进行分析， 选择在结构核的较大侧链的 疏水氨基酸进行改造， 设法制备密码子不 易回复突变的突变氨基酸； (2)设计氨基酸突变引物， 对含有编码所述蛋白质单个结构域基因的大肠杆菌表达质 粒进行突变， 得到至少2 ‑3个密码子碱基与原始氨基酸密码子不同的突变氨基酸的表达质 粒， 然后转 化大肠杆菌得到设计的突变氨基酸的表达 菌株； (3)培养制得的大肠杆菌表达菌株至OD600为0.6‑0.8， 进行IPTG诱导表达， 收集菌体即 得到产目的蛋白菌体； (4)将收集的菌体破碎后 离心， 把含目的蛋白的上清液加到Ni ‑NTA亲和层 析柱上， 然后 用PPase或ULP1酶切， 用洗脱缓冲液将目的蛋白洗脱 下来， 即得到不需要再进一步纯化的高 纯度突变 体蛋白； (5)得到突变体蛋白后， 利用荧光定量PCR试剂Protein  Thermal Shift Dye Kit进行 蛋白质变性温度测定实验， 得到ROX荧光信号随温度升高的熔解曲线， 根据熔解曲线计算突 变体蛋白的变性温度， 确定是否得到蛋白质变性温度降低的突变 体。 2.根据权利1所述降低蛋白质变性温度的方法， 其特征在于： 步骤(1)所述蛋白质单个 结构域是新型冠状病毒结构蛋白N蛋白N端结构域NTD、 新型冠状病毒结构蛋白N蛋白C端结 构域CTD或新型冠状病毒非结构蛋白Nsp7； 选择的突变氨基酸位点是新型冠状病毒结构蛋 白N蛋白N端结构域NTD结构核的108位色氨 酸或132位色氨 酸， 新型冠状病毒 结构蛋白N蛋白 C端结构域CTD结构核的301位色氨 酸、 330位色氨 酸或331位的亮氨酸， 新型冠状病毒非结构 蛋白Nsp7结构核的29位色氨酸、 31位的谷氨酰胺； 所述结构核的较大侧链的疏水氨基酸是 色氨酸、 苯丙氨酸、 组氨酸或 酪氨酸。 3.根据权利2所述降低蛋白质变性温度的方法， 其特征在于： 步骤(1)所述所述蛋白质 单个结构域是新型冠状病毒结构蛋白N蛋白N端结构域NTD， 选择的突变氨基酸位点是新型 冠状病毒结构蛋白N蛋白N端 结构域NTD结构核的132 位色氨酸， 所述结构核的较大侧链的疏 水氨基酸是色氨酸。 4.根据权利1所述降低蛋白质变性温度的方法， 其特征在于： 步骤(2)所述所述的2 ‑3个 密码子碱基与原始氨基酸的密码子不同的突变氨基酸是亮氨酸、 脯氨酸、 组氨酸、 谷氨酰 胺、 异亮氨酸、 苏氨酸、 天冬酰胺、 赖氨酸、 缬氨酸、 丙氨酸、 天冬氨酸或谷氨酸； 所述大肠杆 菌表达载体选pET ‑15b、 pET‑32a或pET ‑28b‑MBP载体； 所述大肠杆菌是E.co li BL21(DE3)。 5.一种获得新型冠状病 毒结构蛋白N蛋白N端结构域NTD蛋白质变性温度降低的突变体 的方法， 步骤是： (1)在网址为https://www1.rcsb.org/structure/7CDZ的PDB数据库下载NTD结构， 在 Coot软件中打开， 分析其氨基酸位置， 其中132位的色氨 酸位于结构核， 选择对132 位色氨酸 进行突变； (2)利用基因合成技术合成NTD基因， 通过聚合酶链式反应扩增得到编码NTD基因核苷 酸序列， 并通过无缝克隆将其连接入pET ‑15b表达载体， 得到表达质粒； 将132 位色氨酸突变 成与其密码子TGG三个碱基皆不同的， 氨基酸密码子为CAT的组氨酸； 设计氨基酸突变引物 NTD W132H上游引物： GGTATTATTcatGTGGCAACCGAAGGTGCA， NTD  W132H下游引物： GGTTGCCAC权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 115353552 A 2atgAATAATA CCATCCTTATTTGCA CCATA， 利用qu ick change方法， 得到NTD  W132H突变体表 达质 粒， 将该表达质粒转化大肠杆菌E.coli  BL21(DE3)， 得到色氨酸(W)突变成组氨酸(H)的突 变氨基酸的表达 菌株； (3)将表达菌株接种于LB培养基中， 菌株培养至OD600为0.6‑0.8， 添加IPTG进行诱导表 达过夜， 收集菌体， 重悬菌体， 高压破碎离心， 把含目的蛋白的上清液加 到Ni‑NTA亲和层析 柱上， 然后PPase酶切过夜， 用洗脱缓冲液将目的蛋白洗脱下来， 即得到不需要再进一步纯 化的高纯度突变 体蛋白， 命名为 N‑NTD W132H突变 体； (4)通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对突变 体蛋白N‑NTD W132H的浓度和纯度进行鉴定； (5)得到突变体蛋白N ‑NTD W132H后， 使用荧光试剂盒Ther mal Shift Dye Kit， 荧光定 量PCR仪QuantStudio  3Real‑Time PCR System检测ROX荧光变化， 得到荧光随温度升高的 熔解曲线， 利用软件Protein  Thermal ShiftTM Software  v1.0分析熔解曲线， 计算N ‑NTD  W132H突变体蛋白的变性 温度， 结果显示变性 温度从野生型的48.9℃降低至37℃， 确定得到 蛋白质变性温度降低的突变 体。 6.权利要求1所述方法制得的一种或几种组合的蛋白质变性温度降低的突变体， 其特 征在于： 突变体分别是32 ‑34℃的N‑NTD W132T或N ‑NTD W108L； 35 ‑36℃的N‑CTD W330N  L331W； 37℃的N ‑NTD W132H； 38℃的N ‑NTD W108H、 Nsp7  W29E Q31F或Nsp7  W29E Q31W； 39‑ 40℃的N‑CTD W301F； 41 ‑42℃的Nsp 7 W29Q或Nsp7  W29T； 43‑45℃的Nsp 7 W29E； 组合35 ‑36 ℃的N‑CTD W330N L331W、 37℃的N‑NTD W132H和38℃的Nsp7  W29E Q31F； 组合35 ‑36℃的N‑ CTD W330N L331W、 37℃的N ‑NTD W132H和38℃的Nsp7  W29E Q31W； 组合32 ‑34℃的N‑NTD  W132T、 35 ‑36℃的N‑CTD W330N L331W和38℃的Nsp7  W29E Q31F； 组合32 ‑34℃的N‑NTD  W132T、 35 ‑36℃的N‑CTD W330N L331W和38℃的Nsp7  W29E Q31W； 组合32 ‑34℃的N‑NTD  W108L、 35 ‑36℃的N‑CTD W330N L331W和38℃的Nsp7  W29E Q31F； 组合32 ‑34℃的N‑NTD  W108L、 35 ‑36℃的N‑CTD W330N L331W和38℃的Nsp7  W29E Q31W； 组合35 ‑36℃的N‑CTD  W330N L331W、 37℃的N ‑NTD W132H和41 ‑42℃的Nsp7  W29Q； 组合35 ‑36℃的N‑CTD W330N  L331W、 37℃的N ‑NTD W132H和41 ‑42℃的Nsp 7 W29T； 组合37℃的N ‑NTD W132H、 38℃的Nsp 7  W29E Q31F和39 ‑40℃的N‑CTD W301F； 组合37℃的N ‑NTD W132H、 38℃的Nsp 7 W29E Q31W和 39‑40℃的N‑CTD W301F； 组合38℃的N ‑NTD W108H和39