(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210679692.1 (22)申请日 2022.06.16 (71)申请人 天津博奥聚 能生物科技有限公司 地址 570311 海南省海口市秀英区秀英街 道长滨七路大华锦绣海岸三期别墅53 栋 (72)发明人 宋文芹　田卫华　 (74)专利代理 机构 北京睿智保诚专利代理事务 所(普通合伙) 11732 专利代理师 周新楣 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6879(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种鉴别菊叶薯蓣超雄株的引物对、 试剂盒 及其筛选方法和应用 (57)摘要 本发明提供了一种鉴别菊叶薯蓣超雄株的 引物对、 试剂盒及其筛选方法和应用， 属于菊叶 薯蓣育种技术领域， 所述引物对包括上游引物和 下游引物； 所述上游引物的核苷酸序列如 SEQIDNo .1所示， 所述下游引物的序列如 SEQIDNo.2所示； 所述引物对能够快速高效的鉴 别菊叶薯蓣雌雄株， 并且对于不同质量的模板 DNA均能够实现稳定准确的鉴定 。 权利要求书1页 说明书7页 序列表17页 附图5页 CN 114959099 A 2022.08.30 CN 114959099 A 1.一种鉴别 菊叶薯蓣超雄株的引物对， 其特征在于， 包括上游引物和下游引物； 所述上 游引物的核苷酸序列如SEQ  ID No.1所示， 所述下游引物的核苷酸序列如SEQ  ID No.2所 示。 2.一种鉴别 菊叶薯蓣超雄株的试剂 盒， 其特征在于， 包括权利要求1所述的引物对和检 测试剂。 3.根据权利要求2所述的试剂盒， 其特 征在于， 所述检测试剂包括PCR扩增试剂。 4.权利要求1所述的引物对、 权利要求2或3所述的试剂盒在菊 叶薯蓣全雄育种中的应 用。 5.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于， 所述应用为利用权利要求1所述的引物对 对待检测的菊叶薯蓣的基因组DNA进行PCR扩增， 若扩增产物有且仅有一条159bp的片段， 则 待检测菊叶薯蓣为超雄株， 否则不是超雄株。 6.鉴别菊叶薯蓣超雄株的引物对的筛 选方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 1)将菊叶薯蓣雌、 雄株材料进行转录组学测序获得雌株转录本测序 数据和雄株转录本 测序数据； 2)比较步骤1)中所述的雌株转录本数据和雄株转录本数据， 筛选在雄株转录本数据中 高表达、 并且在雌株转录 本数据中低表达或不表达的S SR位点； 3)根据步骤2)筛 选获得的S SR位点设计初始扩增引物， 4)将设计获得的初始扩增引物进行人工修改获得兼并引物； 所述人工修改为保留初始 扩增引物 中上游引物的第5至第19位碱基， 将初始扩增引物中的下游引物的第9、 11、 13、 15 的碱基替换为 N； 5)分别以菊叶薯蓣雌、 雄株的基因组DNA为模板， 以步骤4)获得的兼并引物进行热不对 称PCR扩增获得扩增产物； 6)将所述扩增产物进行电泳， 挑选 菊叶薯蓣雌、 雄株扩增产物的差异条 带； 7)将步骤6)中获得的差异条带回收， 并测序获得菊叶薯蓣雌、 雄株差异序列， 根据所述 菊叶薯蓣雌、 雄株差异序列设计获得二轮扩增引物； 8)分别以菊叶薯蓣雌、 雄株的基因组DNA为模板， 以步骤7)获得的二轮扩增引物， 进行 第二轮PCR扩增， 获得二轮扩增产物； 9)将所述 二轮扩增产物进行电泳， 挑选 菊叶薯蓣雌、 雄株扩增产物的差异条 带； 10)将步骤9)中获得的差异条带回收， 并测序获得菊叶薯蓣雌、 雄株差异序列， 根据所 述菊叶薯蓣雌、 雄株差异序列设计获得三轮扩增引物， 即为 鉴别菊叶薯蓣超雄株的引物对。 7.根据权利要求6所述的筛选方法， 其特征在于， 步骤1)中的菊叶薯蓣雌、 雄株为6年生 以上的菊叶薯蓣雌、 雄株。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114959099 A 2一种鉴别菊叶薯蓣超雄株的引物对、 试剂盒及其筛选方 法和 应用 技术领域 [0001]本发明属于菊叶薯蓣育种技术领域， 尤其涉及一种鉴别菊叶薯蓣超雄株的引物 对、 试剂盒及其筛 选方法和应用。 背景技术 [0002]菊叶薯蓣(Dioscorea  composita  Hemsl.)是薯蓣科薯蓣属植物。 多年生缠绕性草 本。 地下茎有的形如掌状， 有的棒状迭生； 外 皮粗糙， 黑褐色， 分背腹两面； 根系完全布于腹。 块茎上有芽眼， 肉眼难以识别。 地上茎圆形肉质， 直径0.4 ‑0.7厘米。 叶为单叶互生； 叶连柄 长25‑30厘米、 宽10 ‑15厘米； 主脉突起11 ‑13条； 叶面皱摺或平滑， 心脏楔形或卵圆形或椭圆 形渐尖成尾 状； 叶柄紫色， 或浅或深； 叶终年常绿。 [0003]菊叶薯蓣为雌、 雄异株， 雄株因不结种子而消耗养分少， 产量和皂苷含量比同条件 下相同的雌株高。 但有关薯蓣雌雄性别决定机制的研究相当困乏， 且在自然群体中常常出 现雄性植株产生两性花， 引起自花或异 花授粉。 因此寻找菊叶薯蓣超雄株， 对于开展菊叶薯 蓣的全雄育种十分必要； 但是目前并没有快速高效的鉴别菊叶薯蓣超雄株的方法。 发明内容 [0004]有鉴于此， 本发明的目的在于提供一种能够鉴别菊叶薯蓣超雄株的引 物对、 试剂 盒及其应用。 [0005]本发明提供了一种鉴别菊叶薯蓣超雄株的引 物对， 包括上游引 物和下游引 物； 所 述上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID No.1所示， 所述下游引物的序列如SEQ  ID No.2所示。 [0006]本发明提供了一种鉴别菊叶薯蓣超雄株的试剂盒， 包括所述的引物对和检测试 剂。 [0007]优选的， 所述检测试剂包括PCR扩增试剂。 [0008]本发明还提供了所述的引物对、 所述的试剂盒在菊叶薯蓣全雄育种中的应用。 [0009]优选的， 所述应用为利用所述的引物对对待检测的菊叶薯蓣的基因组D NA进行PC R 扩增， 若扩增产物有且仅有159bp的片段， 则待检测菊叶薯蓣为超雄株， 否则不是超雄株。 [0010]本发明还提供了鉴别菊叶薯蓣超雄株的引物对的筛 选方法， 包括以下步骤： [0011]1)将菊叶薯蓣雌、 雄株各3个生物学重复进行转录组学测序获得雌株转录本测序 数据和雄株转录 本测序数据； [0012]2)比较步骤1)中所述的雌株转录本数据和雄株转录本数据， 筛选在雄株转录本数 据中高表达、 并且在雌株转录 本数据中低表达或不表达的S SR位点； [0013]3)根据步骤2)筛 选获得的S SR位点设计初始扩增引物， [0014]4)将设计获得的初始扩增引物进行人工修改获得兼并引物； 所述人工修改为保 留 初始扩增引物中上游引物的第5至第19位碱基， 将初始扩增引物中的下游引物的第9、 11、 13、 15的碱基替换为 N；说　明　书 1/7 页 3 CN 114959099 A 3