(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210569946.4 (22)申请日 2022.05.24 (83)生物保 藏信息 CCTCC NO： M 202 2554 2022.05.03 (71)申请人 绵阳师范学院 地址 621000 四川省绵阳市高新区绵兴西 路166号 申请人 绵阳晟氏健康科技有限公司 (72)发明人 吴生亮　张彤彤　叶子兰　赵莉　 阮期平　 (74)专利代理 机构 四川省方圆智云知识产权代 理事务所(普通 合伙) 51368 专利代理师 严晓玲 (51)Int.Cl. C12N 15/70(2006.01)C12N 15/53(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C02F 3/34(2006.01) C12R 1/19(2006.01) C02F 101/34(2006.01) (54)发明名称 一种重组表达载体、 降解苯酚的基因工程菌 及其应用 (57)摘要 本发明中公开了一种重组表达载体， 含有苯 酚羟化酶基因， 所述苯酚羟化 酶基因的核苷酸序 列如SEQ ID NO.1所示。 本发明同时提供含有上 述重组表达载体的基因工程菌及该基因工程菌 在降解苯酚中的应用。 本发明从美棒状杆菌中克 隆得到苯酚羟化酶基因， 构建重组表达载体后， 转化入大肠杆菌， 表达得到苯酚羟化酶； 测定其 酶活为105.8 U/ml， 比活度达到了12.3U/mg， 具有 较高的酶活， 可用于高效降解含酚废水， 在工业 废水处理中具有非常广泛的应用前 景。 权利要求书1页 说明书4页 序列表2页 附图2页 CN 114941005 A 2022.08.26 CN 114941005 A 1.一种重组表达载体， 其特征在于， 含有苯酚羟化酶基因， 所述苯酚羟化酶基因 的核苷 酸序列如SEQ  ID NO.1所示。 2.根据权利要求1所述的重组表达载体， 其特征在于， 扩增所述苯酚羟化酶基因 的引物 序列如SEQ  ID NO.2和SEQ  ID NO.3所示。 3.根据权利要求1所述的重组表达载体， 其特征在于， 所述苯酚羟化酶基因来自美棒状 杆菌(corynebacterium  callunae)YZ01， 所述美棒状杆菌YZ01保藏于武汉中国典型培养物 保藏中心， 保藏编号 为： CCTCC NO:M2022554。 4.一种降解苯酚的基因工程菌， 其特征在于， 含有如权利要求1至3任一项所述的重组 表达载体。 5.根据权利要求4所述的基因工程菌， 其特征在于， 所述基因工程菌的宿主菌为大肠杆 菌BL21。 6.如权利要求5所述的基因工程菌在降解苯酚中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114941005 A 2一种重组表达载体、 降解苯酚的基因工 程菌及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及基因工程技术领域， 尤其涉及一种重组表达载体、 降解苯酚的  基因工 程菌及其应用。 背景技术 [0002]苯酚是一种具有高毒性和腐蚀性且难以被自然生态系统净化的有机污染  物， 广 泛存在于石油、 化工、 冶金、 煤气等工业生产所排放的废水中。 苯酚不  仅对人和 动植物等有 明显的毒害作用， 而且不合理的排放还会导致生态环境的  污染。 因此， 它是我国及其他一 些国家优先控制的污染物。 [0003]微生物法处理含酚废水具有处理效率高、 能源消耗少、 处理费用低、 设备  投资较 少、 运行相对简单等优点。 在受酚类化合物及其衍生物污染的环境中，  已经筛选并分离到 多种能够降解苯酚的高效微生物菌种， 通过对其降解性质、  降解条件、 对苯酚的耐受性及 降解效率进行研究， 进 而将其投入到废水处 理系 统中， 得到较好的处 理效果。 [0004]微生物对苯酚的好氧降解过程是利用苯酚羟化酶将苯酚催化转化为邻苯二  酚， 邻苯二酚通过两条不同的途径形成碳氢化合物， 最 终生成乙酰辅酶A、 琥  珀酸、 乙酸和丙酮 酸等中间产物， 进入三羧酸循环， 为微生物的新陈代谢提供  所需要的能量。 苯酚羟化酶的 活性在微 生物对苯酚的降解能力中起决定性作用。 [0005]如何保持降酚菌株的高降解活性、 提高降解速率是生物法处理含酚废水的  主要 问题。 发明内容 [0006]本发明的目的在于解决现有技术中存在的降酚菌株的苯酚羟化酶活性较  低， 对 苯酚的降解速率 不高的问题， 提供一种重组表达载体、 降解苯酚的基因  工程菌及其应用。 [0007]为解决上述技术问题， 本发明采用的技术方案如下： 一种重组表达载体，  含有苯 酚羟化酶基因， 所述苯酚羟化酶基因的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示。 [0008]优选地， 扩增所述苯酚羟化酶基因的引物序列如SEQ  ID NO.2和SEQ  ID NO.3所 示。 [0009]优选地， 所述苯酚羟化酶基因来自美棒状杆菌(corynebacterium  callunae) YZ01， 所述美棒状杆菌YZ01保藏于武汉中国典型培养物保藏中心，  保藏编号为： CCTCC  NO: M2022554。 [0010]本发明同时提供一种降解苯酚的基因工程菌， 该基因工程菌含有上述重组  表达 载体。 [0011]优选地， 所述基因工程菌的宿主菌为大肠杆菌BL21。 [0012]本发明还提供 上述基因工程菌在降解苯酚中的应用。 [0013]本发明所具有的有益效果： 本发明从美棒状杆菌中克隆得到苯酚羟化酶基  因， 构 建重组表达载体后， 转化入大肠杆菌， 表达得到苯酚羟化酶； 测定其酶  活为105.8U/ml， 比说　明　书 1/4 页 3 CN 114941005 A 3