(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202211039465.9 (22)申请日 2022.08.29 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 115109861 A (43)申请公布日 2022.09.27 (73)专利权人 北京惠之衡生物科技有限公司 地址 100025 北京市朝阳区八里庄西里住 邦2000商务中心 2号楼21层 专利权人 吉林惠升生物制药有限公司 (72)发明人 曹海燕　林兆生　王惠　朱志伟　 王丽军　 (74)专利代理 机构 北京开阳星知识产权代理有 限公司 1 1710 专利代理师 吕亚会(51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (56)对比文件 CN 104894042 A,2015.09.09 CN 103146625 A,2013.0 6.12 CN 21510 3263 U,2021.12.10 吉玉辉等.基 于thyA基因的大肠杆菌染色 体-质粒平衡致死系统的构建与应用. 《中国兽医 科学》 .2008,(第11期), 刘国强等.包 含ARS/CEN元件的游离质粒在 巴斯德毕赤酵母中的稳定性研究. 《生物学杂 志》 .2020,(第02期), 审查员 陈果 (54)发明名称 一种重组工程菌中质粒丢失率的检测方法 (57)摘要 本申请涉及一种重组工程菌中质粒丢失率 的检测方法， 所述检测方法包括： 对诱导前后的 重组工程菌分别进行PCR扩增反应， 比较扩增序 列的产物， 确定质粒是否丢失， 计算质粒丢失率。 本申请提供的检测质粒丢失率的方法与平板涂 布法得到的结果基本一致， 且本方法灵敏度高， 重复检测结果稳定， 能够避免平板涂布法的假阴 性的现象。 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 115109861 B 2022.12.02 CN 115109861 B 1.一种重组工程菌中质粒丢失率的检测方法， 其特 征在于， 所述检测方法包括： （1） 根据重组工程菌中重组质粒的非转录翻译区设计特异性引物， 其中， 正向引物为 TGCGCATGATCGTGCTCCTGTCGTT， 反向引物为TGATGCCTCCGTGTAAGGGGGATTT， 所述重组质粒为 重组pET质粒； （2） 取诱导表达后发酵终末的重组工程菌并涂布无抗生素培养基平板培养， 随机挑取 培养基平板上≥30个克隆至含有抗生素的培养基中分别进 行悬浮培养， 对培养的每个克隆 使用步骤 （1） 设计的特异 性引物进行P CR扩增； 所述抗生素为重组工程菌中包含的抗生素抗 性基因对应的抗 生素； （3） 检测 PCR扩增产物结果， 计算质粒丢失率， 质粒丢失率为无扩增结果克隆数/总克隆 数。 2.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 所述步骤 （2） 中挑取的克隆数为≥80 个。 3.根据权利 要求2的所述的检测方法， 其特征在于， 所述步骤 （2） 中挑取的克隆数为100 个。 4.根据权利 要求1所述的检测方法， 其特征在于， 步骤 （3） 中所述检测 PCR扩增产物的方 法为凝胶电泳法， 通过凝胶电泳确定扩增的重组工程菌克隆是否存在扩增产物。 5.根据权利要求1 ‑4任一项所述的检测方法， 其特征在于， 所述重组工程菌为重组大肠 杆菌工程菌。 6.根据权利要求5所述的检测方法， 其特征在于， 还包括如下步骤： 取诱导前菌液保存 备用， 并将保存菌液使用所述引物进行PCR扩增， 作为阳性对照。 7.根据权利要求6所述的检测方法， 其特征在于， 还包括如下步骤： 取空白宿主菌使用 所述引物进行PCR扩增， 作为阴性对照。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115109861 B 2一种重组工 程菌中质粒 丢失率的检测方 法 技术领域 [0001]本申请涉及基 因检测技术领域， 尤其涉及 一种重组工程菌中质粒丢失率的检测方 法。 背景技术 [0002]重组工程菌表达系统 （尤其重组大肠杆菌工程菌） 通常含有表达目的蛋白的表达 质粒， 质粒上会带有抗生素抗性基因， 随着传代代次的提高， 部 分重组工程菌中质粒会发生 丢失， 失去了抗生素抗性基因， 也同时失去表达目的蛋白的能力。 因此， 质粒丢失后的重组 工程菌， 在一定浓度的抗生素环境下(如种子培养液)， 便不能存活， 而在不含抗生素的发酵 培养液中， 菌体可以正常生长 。 [0003]质粒丢失率检测的常规方法为平板涂布培养法， 通过在实验过程中比较在含有 或 不含抗生素培养基的菌体存活数， 可以检测质粒 的丢失率， 从而对质粒稳定性进行一个评 价。 目前， 常用的平板涂布培养法有玻璃珠、 细胞铲 或者玻璃涂布 棒法。 玻璃珠法涂布均匀， 但是玻璃珠分散， 操作回收较麻烦； 细胞铲操作比较麻烦， 不均匀， 容易划破琼脂糖表面； 而 玻璃涂布棒法虽然操作简单， 但是由于平板的琼脂糖表面不平， 导致涂布不均匀， 多个细胞 堆集一起， 不能很好的分离形成单一的细菌菌落， 从而影响活细菌的计数和阳性细菌克隆 的分离， 给实验带来不便。 另外， 受到多种情况影响， 采用常规涂布法还可能会出现假阴性 的情况。 所以提供一种操作简单， 检测结果稳定的质粒丢失率检测方法显得 尤为重要。 发明内容 [0004]为了解决上述技术问题， 本申请提供了一种重组工程菌中质粒丢失率的检测方 法。 [0005]第一方面， 本申请提供了一种重组工程菌中质粒丢失率的检测方法， 检测方法包 括： [0006]（1） 根据重组工程菌中重组质粒的非转录翻译区设计特异性引物； [0007]（2） 取诱导表达后发酵终末的重组工程菌并涂布培养基平板培养， 随机挑取培养 基平板上≥30个克隆分别进行培养， 对培养的每个克隆使用步骤 （1） 设计的特异性引物进 行PCR扩增； [0008]（3） 检测PC R扩增产物结果， 计算质粒丢 失率， 质粒丢失率为无扩增结果克隆数/总 克隆数。 [0009]所述发酵终末是指在经 过诱导后发酵培 养至接近培养结束或培 养结束后。 [0010]优选地， 所述步骤 （2） 为： 取诱导表达后发酵终末的重组工程菌并涂布无抗生素培 养基平板培养， 随机挑取培养基平板上≥30个克隆至含有抗生素的培养基中分别进行培 养， 对培养的每个克隆使用步骤 （1） 设计的特异性引物进行PCR扩增； 所述抗生素为重组工 程菌中包 含的抗生素抗性基因对应的抗 生素。 [0011]进一步优选地， 所述 步骤 （2） 中挑取的克隆数为≥80个， 或具体的为10 0个。说　明　书 1/4 页 3 CN 115109861 B 3