(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210687838.7 (22)申请日 2022.06.17 (66)本国优先权数据 202210631047.2 202 2.06.06 CN (71)申请人 上海迪赢生物科技有限公司 地址 201706 上海市青浦区北青公路10 688 弄25号1层、 2层 (72)发明人 孔育权　李耕慧　胡征　 (74)专利代理 机构 上海骁象知识产权代理有限 公司 31315 专利代理师 赵俊寅 (51)Int.Cl. C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/6848(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01)C40B 50/06(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种超高通 量多重PCR扩增子捕获方法 (57)摘要 本发明涉及二代测序领域， 具体是一种用于 二代测序的超高通量多重PCR扩增子捕获方法， 所述NGS捕获方法包括以下步骤： 1)利用包含可 消化复合修饰引物对待检测的样本进行多重PCR 扩增， 得到PCR产物； 2)利用包含引物消化酶、 纠 错酶和末端 修复酶的第二酶混液对PCR产物进行 酶切反应， 包括用于消化 酶去除扩增产物上多余 引物部分， 利用错配纠错酶去除非特异扩增产 物； 3)利用包含 Index的全长接头进行连接反应， 直接得到测序用的文库或者扩增后得到测序用 文库。 本发 明的方法显著提高了扩增效率和特异 性， 而且步骤简单、 成本低、 时间短， 在遗传病检 测、 肿瘤伴随诊断等基因检测和科学研究领域有 广泛应用价 值。 权利要求书1页 说明书7页 序列表41页 附图7页 CN 114958991 A 2022.08.30 CN 114958991 A 1.一种超高通量多重PCR扩增子捕获方法， 其特征在于， 所述超高通量多重PCR扩增子 捕获方法包括以下步骤： 1)利用包含可消化复合修饰的扩增引物池和第一酶混液对待检测的样本进行多重PCR 扩增， 得到扩增子产物； 所述扩增引物池中的扩增引物至少有一条包含复合修饰碱基核苷 酸， 且修饰方式存在下列中的一种或几种情况： T碱基替换为尿嘧啶修饰碱基， T碱基替换为 锁核苷酸胸腺嘧啶修饰碱基， T碱基替换为5甲基胞嘧啶修饰碱基， T碱基替换为锁核苷 酸腺 嘌呤修饰碱基， G碱基替换为8 ‑羟基脱氧鸟苷修饰碱基， 和T碱基替换为次黄嘌 呤修饰碱基； 所述第一酶混液为 QuarTaq HotStart混合液； 2)利用包含引物消化酶、 错配纠错酶和末端修复酶的第 二酶混液对扩增子产物进行酶 切反应， 包括用引物消 化酶去除扩增产物上多余引物部分， 利用错配纠错酶去除非特异扩 增产物； 所述第二酶混液包括引物消化酶、 错配纠错酶、 T4多聚核苷酸激酶、 Taq聚合酶和 QuarPrep末端修复加尾缓冲液； 所述引物消化酶选自UDG酶和FPG酶中的一种或两种； 所述 错配纠错酶选自T7核酸内切酶I、 T4核酸内切酶VII、 E  coli核酸内切酶V、 Surveror核酸内 切酶和CEL I核酸内切酶中的一种或几种； 3)利用包含Index的全长接头和第三酶液进行连接反应， 直接得到测序用的文库或者 扩增后得到测序用文库； 所述第三酶液为DNA连接酶。 2.根据权利要求1所述的超高通量多重PCR扩增子捕获方法， 其特征在于， 对于任一条 包含复合修饰碱基核苷 酸的扩增引物， 其被修饰的碱基数量为0到n之 间的任一整 数， n代表 该条扩增引物总长度。 3.根据权利要求1所述的超高通量多重PCR扩增子捕获方法， 其特征在于， 利用包含 Index的全长 接头和第三酶液进行 连接反应后直接得到测序用文库。 4.根据权利要求1所述的超高通量多重PCR扩增子捕获方法， 其特征在于， 所述错配纠 错酶用于降低PCR扩增产生的非特异。 5.根据权利要求1所述的超高通量多重PCR扩增子捕获方法， 其特征在于， 所述包含 Index的全长 接头替代通用短接 头进行连接反应构建测序用文库。 6.根据权利要求1所述的超高通量多重PCR扩增子捕获方法， 其特征在于， 所述待检测 的样本选自原核或真核微 生物基因 组、 动物或植物基因 组或人基因 组。 7.根据权利要求1所述的超高通量多重PCR扩增子捕获方法， 其特征在于， 所述扩增引 物池包含如SEQ ID NO:1‑262所示的引物。 8.根据权利要求1所述的超高通量多重PCR扩增子捕 获方法在如下任一方面的应用： 病 原体检测， 遗传病检测， 肿瘤早筛检测， 肿瘤伴随诊断检测， 易感基因检测等。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114958991 A 2一种超高通量多重PCR扩增子捕获方 法 技术领域 [0001]本发明涉及二代测 序领域， 具体涉及一种基于超高通量多重PC R扩增子捕获方法， 特别适用于PCR扩增子较多的二代测序应用。 背景技术 [0002]高通量测序技术， 在有些文献中称其为下一代测序技术(Next  generation   Sequencing， NGS)， 是对传统测序(Sanger测序)一次划时代的革命性的改变， 一次测序可对 几十万到几百万条DNA分子序列进行测定 。 [0003]NGS中的靶向捕获技术包含基于探针的液相杂交捕获和基于多重PCR的扩增子法 捕获技术。 多重PCR(Multiplex  PCR)捕获， 又称多重引物PCR捕获， 它是在同一个PCR反应体 系中加入两对以上的引物， 同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。 其反应原理， 反应试剂和 操作过程与一般PCR相同， 但多重P CR在很多应用中有巨大的优势： 1.更高的通量(每个 反应 孔可分析 更多片段)； 2.更低的样本用量和试剂用量(特别适 合珍稀样品， 降低成本)。 [0004]随着近几年高通量测 序技术的发展， 科研及临床应用端对单次反应引物对数的要 求不断增加， 传统多重PCR技术所面对的一个难题是， 不同的引物对之间， 杂交动力学性质 不同。 结合效率更高的引物能更充分的利用P CR反应试剂， 从而导致其它P CR产物的减少。 这 通常会导致一些本应该被扩增的产 物没有扩增。 这一难题， 成为了多重P CR单管扩增子数量 增长的主要限制因素， 行业内主流的解决方案是通过将多个扩增子分成多管进行扩增反 应， 但是这会导致样本及试剂用量的增加。 另外传统的多重PCR扩增子扩增均一性不好， 需 要反复调整， 单管中引物对 数过多会产生严重干扰。 因此有必 要开发一种能够提高多重P CR 单管扩增子数量， 同时又确保或提高扩增均一 性的方法。 [0005]专利文献CN110592200A公开了一种改善扩增特异性和均一性的多重PCR方法。 该 方法包括： 从样本中提取基因组DNA； 将所提取到的基因组DNA进行片段化， 并进行纯化； 以 经纯化的基因组DNA 为模板， 使用多个特异性引物对， 进行PCR扩增反应， 其中， 在所述P CR扩 增反应中， 使用由低到高的差异化温度进行退火。 该发明对DNA片段化并纯化处理， 可以使 模板与引物快速结合， 提高引物使用率。 先在较低的退火温度模式下， 让扩增引物充分结合 到模板DNA上， 再逐步提高退火温度， 提高各引物结合的特异性； 这使 得多重PCR的扩增特异 性和均一 性得到明显改善 。 [0006]而目前未见如本申请所述的超高通 量多重PCR扩增子捕获方法。 发明内容 [0007]本发明的目的是提供一种多重PC R单管扩增子数量多、 扩增 均一性好、 能显著提高 扩增效率的超高通 量多重PCR扩增子捕获方法。 [0008]本发明采取的技 术方案如下： [0009]一种超高通量多重PC R扩增子捕获方法， 所述超高通量多重PCR扩增子捕获方法包 括以下步骤：说　明　书 1/7 页 3 CN 114958991 A 3