(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210777730.7 (22)申请日 2022.07.04 (71)申请人 中国科学院南京土 壤研究所 地址 210008 江苏省南京市玄武区北京东 路71号 (72)发明人 吴宇澄　陈禹竹　何健　曾军　 林先贵　 (74)专利代理 机构 南京禾易知识产权代理有限 公司 32320 专利代理师 谢一龙 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种评价外源微生物在土壤中生长情况的 方法 (57)摘要 本发明提出了一种评价外源微生物在土壤 中生长情况的方法， 包括如下步骤： S1、 于干燥土 壤中添加外源微生物以及H218O进行土壤培养试 验， 采集土壤样品并提取土壤DNA； S2、 分别以 H216O和H218O配制用于培养外源微生物的液体培 养基， 收集所得外源微生物并提取DNA； S3、 分别 将S1中所得土壤DNA以及S2中菌体DNA样品溶解 于氯化铯溶液中进行密度梯度离心， 得不同DNA 沿密度梯度的分布占比； S4、 依据所得不同DNA的 分布占比得土壤中外源微生物DNA的平均密度以 实现外源微生物生长程度的定量评价； 本发明针 对外源微生物独特基因片段进行定量PCR分析， 能够排除土壤中其他微生物的干扰， 对外源微生 物进行高度特异的分析。 权利要求书1页 说明书6页 附图1页 CN 115261498 A 2022.11.01 CN 115261498 A 1.一种评价外源微 生物在土壤中生长动态的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： S1、 向干燥的土壤中添加外源微生物以及H218O进行土壤培养试验， 采集土壤样品并提 取土壤DNA； S2、 分别以H216O和H218O配制用于培养外源微生物的液体培养基， 收集所得外源微生物 并提取DNA； S3、 分别将S1中所得土壤DNA以及S2中16O及18O标记的菌体DNA样品溶解于氯化铯溶液中 并进行超高速密度梯度离心， 得不同DNA沿密度梯度的分布占比； S4、 依据S3中所得不同DNA的分布占比得土壤中外源微生物DNA的平均密度， 从而实现 外源微生物生长程度的定量评价； 所述外源微生物为Sphingomonas  wittichii  DC‑6， 保藏于韩国农业微生物菌种保藏 中心(KoreanAgricultural  Culture Collection,KACC)， 保藏编号 为KACC 16600。 2.根据权利要求1所述的评价外源微生物在土壤中生长情况的方法， 其特征在于， 于 S1‑S3中， 以定量PCR方法对所得DNA样品进行基因定量， 用于定量PCR方法中的引物序列具 体如下： CndAF： CATC CAGTGCCCCTATCACG； CndAR： 2 AATCGCAGTCGAGATGCAG G。 3.根据权利要求2所述的评价外源微 生物在土壤中生长情况的方法， 其特 征在于， 于S1中， 以定量PCR方法对经超高速离心分离后各密度层次DNA样品进行基因定量， 经 加权平均计算后， 所测得的为置 于土壤之内的外源微 生物的DNA的平均密度； 于S3中， 以定量PCR方法对经超高速离心分离后各密度层次DNA样品进行基因定量， 经 加权平均计算后， 所测得的为被16O和18O标记的菌体DNA的平均密度。 4.根据权利要求3所述的评价外源微生物在土壤中生长情况的方法， 其特征在于， 土壤 中新生长的外源微生物DNA占比为S2至S3中以18O标记的DNA量的差值与S1中外源微生物的 DNA总量之比。 5.根据权利要求1所述的评价外源微生物在土壤 中生长情况的方法， 其特征在于， 于S2 中， 所述液体培 养基包括胰蛋白胨10mg/ml， 酵母提取物5mg/ml以及NaCl  10mg/ml。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115261498 A 2一种评价外源微生物在土壤中生长情况的方 法 技术领域 [0001]本发明涉及环境微生物学领域， 尤其涉及 一种评价外源微生物在土壤中生长情况 的方法。 背景技术 [0002]土壤是生命赖以生存的根基， 农业是人类赖以生存的物质基础， 但是目前， 我国乃 至全世界的土壤污染问题已相当严重， 生物强化技术成为一种对受污染土壤进行原 位修复 的有效手段。 生物强化技术是向目标土壤中施加对目标污染物具有一定处理 能力的外源微 生物， 利用其新陈代谢反应进行修复。 外源微生物 能否正常的生长繁殖是微生物强化技术 成败与否的关键。 但是， 目前， 所添加的外源微生物究竟在所 处理的土壤中是否能够长期存 活并保持繁殖能力， 尚未有一个明确的表征手段。 [0003]向土壤中添加功能性菌剂， 使其降解土壤中的污染物、 或促进植物生长， 是极具潜 力的土壤改良手段。 但外源微生物进入土壤后， 面临环境不适应、 土著微生物竞争等问题， 往往不易存活。 为了开发适用于土壤的高效菌剂， 就需要预先对外源微生物在土壤中的生 长潜力进行评估。 所有生命的生长都需要水。 自然界水 分子中的氧原子 绝大多数为16O， 自然 丰度达99％以上， 而重同位素18O的自然丰度仅为约0.2％。 向干燥土壤中加入18O水， 使微生 物仅能摄入18O， 将能使活跃生长微 生物的DNA被18O标记、 密度变大。 [0004]目前， 根据微生物生长对水的需求设计 出来的氧 ‑18(18O)同位素标记方法， 已成为 评估土壤微生物生长的重要技术。 在现有方法中， 对特定土壤样品， 需要 同时设立18O水和 16O水的处理， 经培养后提 取土壤DNA， 经氯化铯密度 梯度离心后， 采用定量PCR等方法测定微 生物16S rRNA基因数量沿氯化铯密度梯度的分布。 比较18O水处理组和16O处理组的分布， 判 断微生物是否被18O标记及其大致 程度， 从而定性 微生物的生长情况。 [0005]现有18O标记技术中， (1)通常采用16S  rRNA基因拷贝数为评估手 段， 因为所有微生 物(细菌)都含有16S  rRNA基因， 所以无 法区分外源微生物和土著微生物； (2)设立18O标记处 理同时必须设立轻同位素16O标记的对照， 通过对比18O标记DNA和16O标记DNA在氯化铯密度 梯度上的位置， 确 认18O对微生物的标记效果。 这一做法工作量大， 测定成本 高， 当土壤样品 较多时难以实行。 (3)比较16S  rRNA基因沿氯化铯密度梯度的分布， 只能进行定性分析， 无 法实现对微 生物生长情况的定量评估。 发明内容 [0006]本发明要解决的技术问题是克服现有技术存在的缺陷， 本发明提出了一种评价外 源微生物在土壤中生长情况的方法， 以解决上述背景技 术中提出的问题。 [0007]为解决上述技术问题， 本发明采用的技术方案是： 一种评价外源微生物在土壤中 生长动态的方法， 包括如下步骤： [0008]S1、 向干燥 的土壤中添加外源微生物以及H218O进行土壤培养试验， 采集土壤样品 并提取土壤DNA；说　明　书 1/6 页 3 CN 115261498 A 3