(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210721562.X (22)申请日 2022.06.24 (71)申请人 福州海关技 术中心 地址 350001 福建省福州市 鼓楼区湖东路 312号 (72)发明人 胡美玲　王沛　陈宇　周卫川　 肖颖　 (74)专利代理 机构 重庆市信立达专利代理事务 所(普通合伙) 50230 专利代理师 朱月明 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种西施舌 荧光PCR探针法检测试剂盒 (57)摘要 本发明属于生物检测鉴定技术领域， 公开了 一种西施舌荧光PCR探针法检测试剂盒， 包括： 一 对特异性荧光引物CADQF与CADQR、 探针CADQP、 2 ×Premix Ex TaqTM PCR和ROXII的实时荧光反 应混合液、 阳性对照、 阴性对照和无核酸酶水； 所 述特异性荧光引物CADQF的序列为： SEQ  ID NO： 1； 所述特异性荧光引物CADQR的序列为： SEQ  ID  NO： 2。 应用本发明的荧光PCR探针法检测试剂盒 既可以快捷高效地判定待测样品是否为西施舌， 且对无法从形态上判定或以西施舌为原料的加 工品中通过荧光PCR探针 法以确定原料种类和含 量， 为商品质量和海样生态学等提供更为便利高 效的方法。 权利要求书1页 说明书7页 序列表1页 附图2页 CN 115029449 A 2022.09.09 CN 115029449 A 1.一种西施舌荧光PCR探针法检测试剂盒， 其特征在于， 所述西施舌荧光PCR探针法检 测试剂盒包括： 一对特异性荧光引物CADQF与CADQR、 探针CADQP、 2 ×Premix Ex TaqTM PCR和ROXII的 实时荧光反应混合液、 阳性对照、 阴性对照和无核酸酶水； 所述特异性荧光引物CADQF的序列为： SEQ  ID NO： 1； 所述特异性荧光引物CADQR的序列 为： SEQ ID NO： 2。 2.如权利 要求1所述西施舌荧光PCR探针法检测试剂盒， 其特征在于， 所述探针CADQP的 序列为： SEQ  ID NO： 3。 3.如权利要求1所述西施舌荧光PCR探针法检测试剂盒， 其特征在于， 所述阳性对照为 浓度100ng/ μL的西施舌DNA提取 液； 所述阴性对照样为浓度10 0ng/ μL的文蛤DNA提取 液。 4.一种利用如权利要求1 ‑3任意一项所述西施舌荧光PCR探针法检测试剂盒的西施舌 快速检测鉴定方法， 其特 征在于， 所述西施舌快速检测鉴定方法包括： 步骤一， 获取待受检对象的DNA作为待检测样品， 并基于所述待检测样品进行荧 光PCR； 步骤二， 获取荧光PCR检测结果， 并基于荧光扩增曲线和阈值判断所述受检对象是否为 西施舌。 5.如权利要求4所述西施舌快速检测鉴定方法， 其特征在于， 所述步骤一中， 基于所述 待检测样品进行荧 光PCR包括： 首先， 在三支EP管中分别加入13μL实时荧光PCR反应混合液 Ⅰ、 3μL实时荧光PCR反应混 合液Ⅱ以及6 μL无核酸酶水； 其次， 将3μL待检测样品、 阳性对照、 阴性对照分别加入EP管， 混匀后置荧光定量PCR仪 进行扩增。 6.如权利要求5所述西施舌快速检测鉴定方法， 其特征在于， 所述扩增反应条件为： 95 ℃预变性5mi n； 95℃变性10s， 6 0℃退火延伸40s， 40个 循环。 7.如权利要求4所述西施舌快速检测鉴定方法， 其特征在于， 所述步骤二中， 获取荧光 PCR检测结果包括： 获取荧光PCR检测结果， 基线以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点 为准； 阴性对照无阈值且无扩增曲线； 阳性对照阈值小于等于 35， 并出现典型的扩增曲线； 若所述性对照、 阴性对照任意 一项不满足以上 条件， 则返回重新进行荧 光PCR检测。 8.如权利要求4所述西施舌快速检测鉴定方法， 其特征在于， 所述步骤二中， 基于荧光 扩增曲线和阈值判断所述受检对象是否为西施舌包括： 若所述阈值小于等于35且所述荧光扩增曲线呈现典型的扩增曲线， 判断所述受检对象 为西施舌； 若所述阈值大于35， 且小于等于40时， 则 再次进行检测； 若所述阈值小于40且所 述荧光扩增曲线呈现典型的扩增曲线， 则判断受检对象为西施舌； 否则， 判断所述受检对象非西施舌或者受检对象中核酸浓度含量过低。 9.一种如权利要求1所述西施舌荧光PCR探针法检测试剂盒在西施舌加工制品检测中 的应用。 10.一种如权利要求1所述西施舌荧光PCR探针法检测试剂 盒在制备检测西施舌或西施 舌加工制品的产品中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115029449 A 2一种西施舌荧光PCR探针法检测试剂盒 技术领域 [0001]本发明属于生物检测鉴定技术领域， 尤其涉及一种西施舌荧光PCR探针法检测试 剂盒。 [0002]本发明提供一种检测西施舌的荧光PCR探针法检测试剂盒。 本发明的内容涉及一 对可以用来检测鉴定西施舌的荧光定量P CR引物和探针， 以及一套包含了实时荧光P CR反应 混合液Ⅰ、 实时荧光P CR反应混合液Ⅱ(含引物、 探针)、 阳性对照、 阴性对照、 无核酸 酶水组成 的荧光PCR探针法检测试剂盒以及相应的检测操作程序。 背景技术 [0003]目前， 西施 舌Coelomactra  antiquata(Spengler,18 02)是经济价值与营养价值很 高的名贵贝类， 与其它贝壳形态相近种难以鉴别。 [0004]西施舌Coelomactra  antiquata(Spengler,18 02)， 又称海蚌、 “贵妃蚌”， 属于软体 动物门Mollusca， 瓣鳃纲Lamellibranchia， 帘蛤目Veneroida， 蛤蜊科Mactridae， 腔蛤蜊属 Coelomactra。 贝壳大， 壳长约40mm～100mm， 略呈三角形,壳质薄， 壳面淡黄色或黄白色， 壳 顶部光滑， 为紫色， 其余壳面有同心生长轮脉， 并被有一层丝娟状土黄色的壳皮。 壳内灰白 色， 顶部淡紫色； 外套窦浅， 半圆形。 生活于潮间带中、 下区的细纱滩上。 西施 舌不仅个体大、 肉质细嫩、 味道鲜美， 还含有多种营养成分,而且其生长快、 外观色泽美丽， 是食 药兼备的名 贵贝类珍品， 也是目前我国贝类增养殖产业中不可多 得的优良品种。 西施舌分布在中国、 日 本、 越南以及印度半岛沿海等太平洋西部海域。 在我国黄海、 东海和南海均有分布， 其中山 东胶南、 江苏南通、 浙江台州、 福建长乐、 广西北海为主要分布区。 但近年来,由于海洋环境 及人为因素影响， 西施 舌自然资源量不断减少。 因地域差异、 养殖方式、 投喂饵料等不同， 其 贝壳形态也会有所变化， 一般人很难从其贝壳的形态加以识别， 还易于白蚌、 中 国蛤蜊等种 类外观较为相似的贝类 混淆。 。 长期从事西施舌相关行业的专 业人士或可从形态区分， 但是 经过加工的产品则无法从形态上难以鉴别。 目前， 西施舌在进出境物种查验中虚报瞒报的 现象较为严重， 在渔业生产、 消费和贸易中掺假造假、 以次充好的现象层出不穷， 严重损害 国际贸易秩序， 危害国门生物安全， 侵害消费者权益。 如果将分子生物学技术应用到西施 舌 的物种鉴定上， 降低对鉴定人员的专 业要求， 这个难题就能得到有效缓解。 因此急 需建立一 种灵敏、 特异的鉴定方法。 [0005]荧光PCR探针法是一种结合探针和实时荧光PCR的方法， PCR之后不需要其它步骤 就能实现对目标DNA片段的定性检测和定量分析。 这种方法不受生物生长发育状态影响， 鉴 定准确性很高， 目前已被广泛应用到生命科学研究众多 领域， 包括物种鉴定和基因分型等。 该技术首次应用到西施舌的物种鉴定上， 不仅为形态上不便于鉴定的西施舌提供了种类的 鉴定， 还可对用于鉴定西施舌加工品的原料， 在商业上和 生态学等科学研究上都有应用价 值。 [0006]通过上述分析， 现有技术存在的问题及缺陷为： 现有的西施舌鉴定方法仍需要专 业人员通过专业软件进行分析， 不够直观， 且鉴定方法不灵敏， 检测效率不高， 没有针对西说　明　书 1/7 页 3 CN 115029449 A 3