(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210668139.8 (22)申请日 2022.06.14 (71)申请人 云南省农业科 学院生物技 术与种质 资源研究所 地址 650000 云南省昆明市盘龙区北京路 延长线2238号 (72)发明人 郑宽瑜　魏治镭　张仲凯　苏晓霞　 熊智琦　张帆　吴阔　 (74)专利代理 机构 北京挺立专利事务所(普通 合伙) 11265 专利代理师 高福勇 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/94(2006.01) (54)发明名称 一种葫芦科种子携带番木瓜环斑病毒PRSV 的RT-PCR检测方法 (57)摘要 本发明公开了检测葫芦科种子携带番木瓜 环斑病毒PRSV的RT ‑PCR检测方法及用途。 其特征 在于， 包括以下几个步骤： 1)种子样品的前处理； 2)样品研磨； 3)RNA提取； 4)RT ‑PCR检测； 5)结果 判断。 本发明可快速、 大量检测葫芦科种子中的 PRSV， 适用于小西葫芦、 黄瓜、 西瓜、 甜瓜等常见 葫芦科的种子携带番木瓜环斑病毒的检测。 本发 明检测方法灵敏度高、 特异性好、 耗时短、 成本 低， 可为葫芦科种子携带番木瓜环斑病毒的快速 检测及科学防控提供技术支 撑， 并为其他种子传 植物病毒的检测提供 借鉴。 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 115029484 A 2022.09.09 CN 115029484 A 1.一种葫芦科种子携带番木瓜环斑病毒PRSV的RT ‑PCR检测方法， 其特征在于， 包括如 下步骤： 1)样品前处理， 将单粒种子样品放入5.0mL离心管， 无菌蒸馏水浸泡过夜； 用手术刀片 辅助镊子进行种皮与种胚的剥离； 2)液氮研磨， 将种皮先进行 液氮处理， 再研磨； 3)样品RNA提取， 向研磨好的样品中添加试剂， 提取RNA： 4)样品RT ‑PCR检测， 使用PRSV特异性引物对目的片段进行扩增， 上游引物PRSV ‑dF： 5′ ‑ GACCTACAAGCGTGACT TTAC‑3′， 下游引物PRSV ‑dR： 5′ ‑CACCCATGCCATGCATCT TTC‑3′； 5)结果判断， 分别将RT ‑PCR的扩增产物、 2000bpDNAMarker、 以及PRSV的阳性对照、 阴性 对照、 空白对照5 μL样 品进行琼脂糖凝胶电泳， 待样 品跑至胶板2/3处时， 停止电泳， 用凝胶 成像仪进行观察拍照； 在PRSV阳性对照扩增出目的条带， 阴性及空白对照无扩增条带情况 下， 如果待检样品扩增条带与阳性大小一致时， 则待检样品判断为阳性； 如果当PRSV阳性扩 增出目的条带， 阴性无条带， 而待检样 品无条带时， 则待检样品判断为阴性； 如果PRSV阳性 无条带或阴性扩增出目的条 带， 则实验无效。 2.根据权利要求1所述的， 其特征在于， 所述步骤2)中， 该液氮处理方法包括以下(a)、 (b)和(c)任意 一种方法： a)单粒种子 的种皮放入2.0mL离心管中， 放入2～3颗5mm灭菌处理的钢珠， 液氮速冻后 使用全自动组织研磨仪进行批量研磨处 理； 研磨仪设置频率 为60HZ， 研磨时间为2 ～3分钟。 b)单粒种子的种皮放入1.5mL离心管中， 在离心管中加入液氮， 使用灭菌处理的电动组 织研磨棒研磨至粉末。 c)单粒种子的种皮放入研钵中， 加入液氮后， 使用研磨棒进行手动研磨至成粉末状。 3.根据权利 要求1所述的， 其特征在于， 所述步骤3)中， 研磨好的样品中加入1mLTRIzol 试剂后， 用常规TRIzol试剂法提取病毒RNA； 或使用植物RNA提取试剂盒提取的总RNA用于 RT‑PCR分子检测。 4.根据权利要求1所述的， 其特征在于， 所述步骤4)中， 先进行反转录操作， 总RNA在65 ℃条件下变性处理5min， 后加入5 ×EasyQuick  RT MasterMix  2μL， RNA Template  6μL， RNase‑Free Water 2 μL， 配制成10 μL反应 体系， 37℃孵 育15分钟。 5.根据权利要求1所述的， 其特征在于， 所述步骤4)中， PCR反应体系为20μL， 2 ×Taq  Master Mix 10 μL， cDNA  template 3 μL， RNase ‑Free Water 6 μL， PRSV ‑dF 0.5 μL， PRSV ‑dR  0.5 μL； 预变性温度98℃， 时间10s； 变性温度98℃， 时间10s； 退火温度55℃， 时间40s； 延申温度 72℃， 时间3 0s； 30循环； 终止延伸温度72℃， 时间5mi n。 6.根据权利要求1所述的， 其特征在于， 所述步骤5)中， 琼脂糖凝胶电泳操作中， 先点入 1.2％琼脂糖凝胶 胶孔， 然后再120V电压， 80mA电流条件下进行琼脂糖凝胶电泳 。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115029484 A 2一种葫芦科种子携 带番木瓜环斑病毒P RSV的RT‑PCR检测方 法 技术领域 [0001]本发明涉及农业技术领域， 特别涉及一种葫芦科种子携带番木瓜环斑病毒PRSV的 RT‑PCR检测方法。 背景技术 [0002]番木瓜环斑病毒(Papaya  ring spot virus， PRSV)属于马铃薯Y病毒科 (Potyvirudae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)。 PRSV有两个株系， 番木瓜环斑病毒番木瓜株系 PRSV‑P以及和番木瓜环斑病毒西瓜株系PRSV ‑W。 其中PRSV ‑P主要侵染番木瓜， 也可侵染葫 芦科作物； 而PRSV ‑W只侵染葫芦 科作物， 是葫芦 科作物上的主要病原。 在我国广东、 广西、 云 南、 山东、 海南等地的西葫芦、 南瓜、 冬瓜、 罗汉果上爆发流行。 [0003]PRSV在葫芦科作物 上引起叶片褪绿、 花叶、 畸形的症状， 在果实上引起畸形、 斑驳、 表面凸起、 疱斑等症状， 严重影响葫芦科作物的产量与品质， 严重时造成绝产。 [0004]在自然界中PRSV一般通过蚜虫等昆虫介体以非持久性方式传播。 据报道可传播 PRSV‑P的蚜虫有棉蚜(Aphis  gossypii)、 玉米蚜(Rhopalosiphum  maidis)、 桃蚜(Myzus   persicae)、 萝卜蚜(Mustard  aphid)等大约11个属的21种蚜虫； 传播PRSV ‑W的蚜虫包括15 个属的24种蚜虫， 其中传播效率最高的是棉蚜和桃蚜。 有翅蚜的迁飞和试探性取食是PRSV 在田间广泛传播的主要途径。 但除此之外， 本研究团队经研究证实， PRSV可通过种子携带病 毒进行传播， 并且通过对PRSV 流行病学的研究， 发现种子带毒 是一个非常重要的初侵染源， 是田间PRSV爆发流行的重要因素。 [0005]种子带毒是PRSV远距离传播的重要途径。 带毒种子在田间作为初侵染源， 通过介 体因素进 行二次传播， 进而造成严重损失。 因此， 建立健全番茄斑萎病毒的种子病毒检测方 法， 对种子上的PRSV进 行快速、 灵敏及准确的检测鉴定， 对于从源头上控制该病毒通过种子 贸易和远距离调运而扩散蔓延， 降低该病毒在田间的危害性， 保护葫芦科作物产业发展具 有重要意 义。 [0006]早期的病毒检测主要以生物学鉴定及电镜检测技术为主。 生物学鉴定存在耗时 长、 工作量大， 准确性低的问题。 电镜检测可直观地观察病毒的形态、 大小、 表面结构等。 但 对设备条件要求高， 需专业人员操作， 不适合于大规模检测。 血清学检测是一种快速、 应用 范围交广的检测技术。 其中应用最广泛的是酶联免疫吸附法(ELISA)， 其原理基于抗原 ‑抗 体特异性结合的免疫反应， 再进一步通过显色底物进 行显色反应进而判断样品中是否含有 抗原。 血清检测具有操作简单、 快速、 特异 性强等特点， 缺点是 受自身抗体、 非特异 性抗体等 干扰， 易出现假阳性； 另外针对微量的样本， 如单粒种子， 灵敏度不够， 不适合用于种子检 测。 发明内容 [0007]本发明所要解决的技术问题是提供一种葫芦科种子携带番木瓜环斑病毒PRSV的 RT‑PCR检测方法， 目RT ‑PCR是基于聚合 酶链式反应的一种体外DNA扩增技术， 其原理是通过说　明　书 1/4 页 3 CN 115029484 A 3