(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210626396.5 (22)申请日 2022.06.02 (71)申请人 广东省农业科 学院植物保护研究所 地址 510640 广东省广州市天河区金颖路7 号广东省农业科 学院植物保护研究所 (72)发明人 苏湘宁　吴优利　廖章轩　赖家盛　 章玉苹　李传瑛　黄少华　刘伟玲　 (74)专利代理 机构 北京深川专利代理事务所 (普通合伙) 16058 专利代理师 张彦 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种草地贪夜蛾对氯虫苯甲酰胺抗性基因 的分子检测方法 (57)摘要 本发明提供了一种草地贪夜蛾对氯虫苯甲 酰胺抗性基因的分子检测方法， 氯虫苯甲酰胺抗 性基因的分子检测方法的具体步骤如下： S1： 以 待检测草地贪夜蛾基因组DNA为模板， 对草地贪 夜蛾基因组DNA进行PCR扩增； S2： 采用敏感引物 对草地贪夜蛾基因组DNA进行扩增， 采用抗性引 物对草地贪夜蛾基因组DNA进行扩增； 本发明通 过敏感引物对和抗性引物能够有效鉴定出草地 贪夜蛾的鱼尼丁受体基因是否发生了G4946E突 变， 从而判断草地贪夜蛾对氯虫苯甲酰胺的敏 感 度或抗药性， 具有快速、 高效、 灵敏度高等特点， 对于监测草地贪夜蛾田间种群对氯虫苯甲酰胺 的抗性基因频率和抗性发生动态， 及时调整防治 策略， 指导合理用药， 延缓抗性发展具有重要的 指导作用。 权利要求书1页 说明书4页 CN 114921571 A 2022.08.19 CN 114921571 A 1.一种草地贪夜蛾对氯虫苯甲酰胺抗性基因的分子检测方法， 其特征在于， 所述氯虫 苯甲酰胺抗性基因的分子检测方法 的具体步骤如下：  S1： 以待检测草地贪夜蛾基因组DNA 为模板， 分别选取敏感引物对和抗性引物对草地贪夜蛾基因组DNA进行PCR扩增；  S2： 采用 敏感引物对草地贪夜蛾基因组DNA进行扩增， 得到扩增产物A， 采用抗性引物对草地贪夜蛾 基因组DNA进 行扩增， 得到扩增产 物B； S3： 比较扩增产物A和扩增产物B的大小， 当扩增产物 A大于等于65bp， 而扩增产 物B小于等于65bp时， 则待检测草地贪夜蛾基因型为敏感基因型；   S4： 比较扩增产物A和扩增产 物B的大小， 当扩增产物A小于等于65b p， 而扩增产物B大于等于 65bp时， 则待检测草地贪夜蛾基因型为抗性基因型；  S5： 比较扩增产物A和扩增产物B的大 小， 当扩增产物A大于等于65bp， 而扩增产物B大于等于65bp时， 则待检测草地贪夜蛾基因型 为混合基因型。 2.根据权利要求1所述的一种草地贪夜蛾对氯虫苯甲酰胺抗性基因的分子检测方法， 其特征在于， 所述敏感引物对由上游引物A和下游引物A组成， 所述上游引物A由下列序列组 成： 5’ ‑TACTAGACGTCGCTGACG， 所述下游引物 A由下列序列组成： 5 ’ ‑TGTTTCCCATTATGGGTGAC。 3.根据权利要求1所述的一种草地贪夜蛾对氯虫苯甲酰胺抗性基因的分子检测方法， 其特征在于， 所述抗性引物对由上游引物B和下游引物B组成， 所述上游引物B由下列序列组 成： 5’ ‑TACTAGACGTCGCTGACG， 所述下游引物B由下列序列组成： 5 ’ ‑TGTTTCCCATTATGGGTGAC。 4.根据权利要求1所述的一种草地贪夜蛾对氯虫苯甲酰胺抗性基因的分子检测方法， 其特征在于， 所述上游引物A和上游引物B的末端第3位和第4位核苷酸引入了错配碱基C和 A。 5.根据权利要求1所述的一种草地贪夜蛾对氯虫苯甲酰胺抗性基因的分子检测方法， 其特征在于， 所述上游引物A的末端第1位核苷酸与突变前的核苷 酸一致， 所述上游引物B末 端第1位核苷酸与突变后的核苷酸 一致。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114921571 A 2一种草地贪夜蛾对氯虫苯甲酰胺抗性基因的分子检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于氯虫苯甲酰胺抗性基因检测技术领域， 涉及 一种草地贪 夜蛾对氯虫苯 甲酰胺抗 性基因的分子检测方法。 背景技术 [0002]草地贪夜蛾是夜蛾科灰翅夜蛾属的一种蛾。 成虫在夜间活动， 在植物叶子顶部产 约100粒卵， 卵阶段是在25℃的温度下持续3天。 新孵出的幼虫以卵壳本身为食， 然后静置2 ‑ 10小时。 幼虫即毛毛虫更喜欢以新叶为食， 由于它们的食性习惯， 通常会各自找到一片新 叶， 幼虫改变皮肤七次， 并在最后的一次离开墨囊， 穿透0.5厘米深的土壤， 在那里它们变成 蛹， 草地贪夜蛾在农业上属于害 虫， 其幼虫可大量啃食禾本科如水稻、 甘蔗和玉米之类细粒 禾榖及菊科、 十字花科等多种农作 物， 造成严重的经济损失， 其 发育的速度会随着气温的提 升而变快， 一 年可繁衍数代， 一只雌蛾即可产下超过10 00颗卵。 [0003]氯虫苯甲酰胺属双酰胺类杀虫剂， 对鳞翅目害虫有非常突出的防效。 其作用机制 新颖， 能够激活鱼尼丁受体， 使细胞内钙释放通道， 导致贮存钙离子的失控性释放， 导致昆 虫瘫痪死亡， 是目前为数不多的作用于昆虫细胞鱼尼丁受体的化合物， 氯虫苯 甲酰胺自在 国内正式登记后， 快速大面积用于防治草地贪夜蛾等多种鳞翅目害 虫， 随着药品的使用， 草 地贪夜蛾的抗药性逐渐增 加。 [0004]申请号201210537546.1公开了一种快速鉴定小菜蛾鱼尼丁受体基因突变的方法 及其专用引物， 提供了一种特异引物组合物， 由序列表的序列 1所示单链DNA分子、 序列2所 示单链DNA分子和序列3所示单链DNA分子组成， 所述特异引物组合物可用以如下(a)或(b)： (a)鉴定小菜蛾是否发生了鱼尼丁受体基因的G4899E突变； 所述鱼尼丁受体基因的G4899E 突变指的是鱼尼丁受体基因的开放阅读 框自5’末端第14696位核苷 酸由G突变为A； (b)辅助 鉴定小菜蛾对双酰胺类杀虫剂的抗性， 本发明提供的特异引物组合物及其应用对于监测小 菜蛾田间种群对双酰胺类杀虫剂的抗性基因频率和对双酰胺类杀虫剂抗药性发生发展动 态， 及时调整 小菜蛾防治策略， 指导 合理用药、 延缓抗 性发展具有重要意 义。 [0005]但是草地贪夜蛾和小菜蛾分属于鳞翅目不同的科， 包含该鱼尼丁受体基 因突变位 点的基因序列也 不尽相同， 因此需要提供针对性更强的方法和专用引物进行分子检测。 发明内容 [0006]本发明的目的在于提供一种草地贪夜蛾对氯虫苯甲酰胺抗性基因的分子检测方 法， 以解决上述背景技 术中提出的问题。 [0007]本发明的目的可通过 下列技术方案来实现： [0008]一种草地贪夜蛾对氯虫苯甲酰胺抗性基因的分子检测方法， 所述氯虫苯甲酰胺抗 性基因的分子检测方法的具体步骤如下： [0009]S1： 以待检测草地贪夜蛾基因组D NA为模板， 分别选取敏感引物对和抗性引物对草 地贪夜蛾 基因组DNA进行PCR扩增；说　明　书 1/4 页 3 CN 114921571 A 3