(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210830585.4 (22)申请日 2022.07.15 (71)申请人 西北农林科技大 学 地址 712100 陕西省咸阳市杨陵区 邰城路3 号 申请人 杭州市余杭区伯宇智慧健康研究院 (72)发明人 杨藩　鲁国涛　杨继鸿　阮见　 高启丰　 (51)Int.Cl. C12N 15/85(2006.01) C12N 15/89(2006.01) C12N 15/113(2010.01) C12N 15/12(2006.01) A01K 67/027(2006.01) C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6806(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种能够区分Tbx1两种可变剪切体的基因 修饰小鼠的制备方法 (57)摘要 本发明提供了一种能够区分Tbx1两种可变 剪切体的靶向载体及其基因修饰小鼠的制备方 法， 包括设计和构建Tbx1  201和203可变剪切体 的靶向载体的步骤， 选择Tbx1  201和203一号内 含子作为编辑位点， 通过显微注射将靶向载体、 guide RNA和Cas9蛋白共同注入小鼠受精卵中。 本发明的基因修饰小鼠， 能够准确区分Tbx1的两 种剪切体， Tbx1  203突变纯合型小鼠心 脏流出道 发育存在明显缺陷， 这为揭示Tbx1两种可变剪切 体在先天性心脏病发生过程的作用机制提供了 可靠的动物模型。 权利要求书2页 说明书7页 附图4页 CN 115029382 A 2022.09.09 CN 115029382 A 1.一种能够区分Tbx1两种可变剪切体的靶向载体及其基因修饰小鼠的制备方法， 其特 征在于： 设计和构建Tbx1  201和203可变剪切体的靶向载体的步骤； 选择Tbx1 201和203一号内含子作为编辑 位点； 通过显微注射将靶向载体、 guide  RNA和Cas9蛋白共同注入小鼠受精卵中。 2.如权利要求1所述的区分Tbx1两种可变剪切体的靶向载体及其基因修饰小鼠的制备 方法， 其特 征在于： 基因修饰小鼠通过PCR和基因测序方法筛 选子代阳性小鼠。 3.如权利要求3所述的区分Tbx1两种可变剪切体的靶向载体及其基因修饰小鼠的制备 方法， 其特 征在于： 与Tbx1可变剪切体相匹配的guide  RNA序列1为： CT TTCGGTCAAG GACTTAGTAGG 与Tbx1可变剪切体相匹配的guide  RNA序列2为： CTG GGACTCTTC GAATTCGAGGG。 4.如权利要求1所述的区分Tbx1两种可变剪切体的靶向载体及其基因修饰小鼠的制备 方法， 其特 征在于： 胚胎分离和显微注射 流程： 1） 第一天， 选择3~4周龄C57BL/6J雌性小鼠， 每只小鼠腹腔注射5  IU孕马血清促性腺激 素(PMSG)， 48  h后腹腔注射5  IU人绒毛膜促 性腺激素(H CG)， 注射后立刻与2~8月雄鼠交配； 2） 第二天， 上午9点前检查小鼠阴道栓， 将供体雌鼠与雄鼠分离； 3） 第四天， 从雌鼠输卵管中收集受精卵， 卵丘细胞放置于含有0.1%牛透明质酸酶的M2 培养基中； 释放受精卵， 置 于37℃， 5%的CO2培 养箱中培 养； 4） 在倒置 显微镜下， 挑选形态正常， 透明带和雄原核清晰的受精卵用于 显微注射； 5） 用吸持毛细管吸住受精卵， 将酶切鉴定正确的靶向载体、 guide  RNA和Cas9  蛋白共 同注射到受精卵的细胞质中； 6） 显微注射300~400枚受精卵， 将注射后的受精卵在M16 （Sigma） 培养基中， 在37℃、 5%   CO2培养箱中培 养1小时； 7） 在显微注射前一天准备3~6月龄的代孕雌鼠， 腹腔注射120  mg/kg氯胺酮和16  mg/kg 甲苯噻嗪麻醉代孕的雌鼠， 置 于恒温台上； 8） 用无菌剪刀剪开小鼠腹腔的皮肤， 把代孕雌鼠子宫角拉出， 用0.9％N aCl溶液保持湿 度， 固定好子宫； 9） 用镊子夹住输卵管壶腹上端， 在输卵管壁形成一个小孔； 用细玻璃毛细 管注射20~30 枚受精卵至每只代孕雌鼠的输卵管中； 10） 将子宫重新 放入小鼠体内， 手术缝合后将小鼠放入饲养笼中饲养； 11） 待小鼠出生2~3周后， 剪耳编号， 剪尾后提取基因组， PCR扩增片段， 测序鉴定， 获得 阳性F0代小鼠； 12） 性成熟的阳性F0代小鼠分别与野生型C57BL/6J小鼠交配获得F1代小鼠， 出生后2周 龄左右的子代小鼠剪尾后提取基因 组， 用引物序列3和引物序列4进行PCR鉴定 。 5.如权利要求4所述的区分Tbx1两种可变剪切体的靶向载体及其基因修饰小鼠的制备 方法， 其特 征在于， 还 包括： 小鼠基因型的鉴定过程：权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115029382 A 21） 剪取0.1 ‑0.2 cm的小鼠尾巴于1.5  ml EP管中， 加入150  μl NaOH (50mM)裂解缓冲 液； 2） 保证裂解液没过样品， 6 5℃恒温水浴锅中孵 育过夜； 3） 12000 rpm离心2分钟， 吸取 上清； 4） 加入20  µl Tris‑HCl (1M, PH7.5)， 充分 混匀； 5） 酚： 氯仿： 异戊醇=25:24:1的比例加入15 0 μl混合液， 涡旋振荡混匀； 6） 12000 rpm离心2分钟， 吸取 上清至新的EP管中； 7） 加入1 ml预冷的无 水乙醇， 充分 混匀， 4℃， 120 00 rpm离心10分钟， 弃 上清； 8） 超净工作台 中干燥， 用10 0 μl双蒸水 溶解沉淀， 取2 μl作为模板进行PCR鉴定 。 6.权利要求5所制备的区分Tbx1两种可变剪切体的靶向载体及其基因修饰小鼠的制备 方法， 其特 征在于： F0代小鼠PCR产物判定， 阳性小鼠分别命名为TMV （Tbx1  201 flox‑V5‑G15） 和TMF （Tbx1   203 flox‑3xFlag‑C9） ： 1） TMV阳性小鼠经引物序列1中的TMV ‑1扩增后含有3.0  kb和4.1 kb片段， TMV ‑2 扩增 后产物大小为6.2  kb； TMV‑1扩增后只有4.1  kb片段， TMV ‑2扩增无片段为阴性小鼠； 2） TMF阳性小鼠通过引物序列2中的TMF ‑1扩增出4.9  kb片段， TMF ‑2扩增得到4.8  kb片 段， 而阴性小鼠扩增无片段； F0代小鼠PCR扩增所用引物序列如下： 引物序列1 TMV‑1F： 5’   ‑ACAGGCGGTGCTTGTCTTAG‑3’ TMV‑1R： 5’   ‑AAGAGAGGCGATGCTGA ACG‑3’ TMV‑2F： 5’   ‑AGCATCGC CTCTCTTAAGTCC‑3’ TMV‑2R： 5’   ‑GCCTCTGATG GGGAGTTTCC‑3’ 引物序列2 TMF‑1F： 5’   ‑GCAAGATTTGCAGCTTATTAGCC‑3’ TMF‑1R： 5’   ‑GTGGATTCGGACCAGTCTGA ‑3’ TMF‑2F： 5’   ‑ACGTAAACGGCCACAAGTTC‑3’ TMF‑2R： 5’   ‑TGGATTTGGCGTCACTAGC CAG‑3’。 7.如权利要求6所述的区分Tbx1两种可变剪切体的靶向载体及其基因修饰小鼠的制备 方法， 其特 征在于， 还具有： 子代小鼠PCR扩增所用引物序列如下： 引物序列3： TMV‑3F： 5’   ‑CGTTCAGCATCGC CTCTCTT‑3’ TMV‑3R： 5’   ‑GCCTGACAGTATAGACGCG G‑3’ 引物序列4： TMF‑3F： 5’   ‑TGAAAAGCGGATGAAGGTGCAG‑3’ TMF‑3R： 5’   ‑GGAAAATGAGCGCA ATGGCTTTTA‑3’。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115029382 A 3