(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210637267.6 (22)申请日 2022.06.07 (71)申请人 宁波大学 地址 315211 浙江省宁波市江北区风 华路 818号宁波大 学 (72)发明人 柏阳阳　周素明　舒凤玲　 (74)专利代理 机构 宁波甬致专利代理有限公司 33228 专利代理师 李迎春 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的检测方 法 (57)摘要 本发明提供了一种美人鱼发光杆菌美人鱼 亚种的检测方法， 包括从美人鱼发光杆菌美人鱼 亚种的单菌落中提取DNA或从待检鱼组织中提取 DNA， 以及设计基于亚种水平的特异引物， 以待测 样本的DNA为模板， 通过上游引物P1与下游引物 P2对进行PCR扩增检测， 进行电泳分析， 通过本发 明能够对在临床上对美人鱼发光杆菌美人鱼亚 种及杀鱼亚种进行准确的区分， 在水产养殖中具 有较高的应用价 值。 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 115109858 A 2022.09.27 CN 115109858 A 1.一种美人鱼发光杆菌 美人鱼亚种的检测方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： S1： 将待测样本的DNA提取； S2： 基于美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的cyclic  di‑GMP phosphodiesterase基因序列 作为检测靶序列， 以其种间及亚种间变异区设计1对种特异引物P1与P2， 所述P1与P2的序列 如下： 上游引物P1:5'T TGTACTAT TTTTAACAAACTTGGCTA3'， 下游引物P2:5'C CTAATGTTTGTAAGCGAGTTAGCG 3'； S3： 以待测样本 的DNA为模板， 通过上游引 物P1与下游引 物P2对进行实时荧光PCR扩增 检测， 进行电泳分析， 即完成鉴定 。 2.根据权利要求1所述美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的检测方法， 其特征在于， 所述步骤 S1中， 所述将待测样 本的DNA提取包括 从美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的单菌落中提取DNA或 从待检鱼组织中提取DNA。 3.根据权利要求2所述美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的检测方法， 其特征在于， 所述从美 人鱼发光杆菌美人鱼亚种的单菌落中提取DNA包括以下步骤： 挑取美人鱼发光杆菌美人鱼 亚种的单菌落到液体培养基中进 行摇床培养过夜， 去除上清液后加水混合后， 继续离心， 再 次去除上清液后加水得到 混合液， 将混合液置于沸水中水浴加热3 ‑7分钟后取出， 再次离心 后取上清液， 所述上清液即为美人鱼发光杆菌 美人鱼亚种DNA提取 液。 4.根据权利要求2所述美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的检测方法， 其特征在于， 所述从待 检鱼组织中提取DNA包括以下步骤： 取待检测组织进 行裂解离心， 提取沉淀溶于无菌水即得 美人鱼亚种DNA。 5.根据权利要求1所述的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的检测方法， 其特征在于， 所述步 骤S3中， 所述PCR扩增检测的反应体系为： 2 ×Taq Master Mix 12.5 μl， 模板DNA  1 μl， ddH2O  9.5 μl， 10 μM的上 下游引物各1 μl。 6.根据权利要求1所述的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的检测方法， 其特征在于， 所述步 骤S3中， 所述PCR扩增检测的反应条件为： 94℃变性2min； 94℃  30s， 54℃  30s， 72℃  30s， 35 个循环； 72℃延伸2mi n。 7.根据权利要求1所述的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的检测方法， 其特征在于， 所述步 骤S3中， 所述电泳分析具体包括： 对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测， 具有可见条带的为 受美人鱼发光杆菌美人鱼亚种感染组织， 反之则为未 受美人鱼发光杆菌美人鱼亚种感染组 织。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115109858 A 2一种美人鱼发光杆菌美人鱼 亚种的检测方 法 技术领域 [0001]本发明涉及生物检测领域， 具体而言， 涉及一种美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的检 测方法。 背景技术 [0002]美人鱼发光杆菌(Photobacterium  damselae)分为两个亚种， 分别为美人鱼发光 杆菌美人鱼亚种(P.damselae  subsp.damselae,PDD)和美人鱼发光杆菌杀鱼亚种 (P.damselae subsp.piscicida， P DP)， 都是广泛分布于海洋环境中的革兰氏阴性 致病菌。 [0003]美人鱼发光杆菌美人鱼亚种感染的宿主种类多样， 包括甲壳类、 鱼类、 哺乳类甚至 是人类， 比如造成甲壳动物结节病， 引起鱼类坏死性筋膜炎、 造成多个器官衰竭， 引起出血 症等。 而美人鱼发光杆菌杀鱼亚种就 目前的报道来看仅感染鱼类。 这两种亚种的美人鱼发 光杆菌的同源性极强， 看家基因gyrB、 toxR和omp U都不能精确的区分这两种亚种， 甚至二者 的16srRNA序列只相差一个碱基， DNA ‑DNA杂交相似性达到了80％， 导致鉴定美人鱼亚种的 难度增加。 有文献报道说这两个亚种在某些生化指标上存在着不同， 比如精氨酸二氢酶和 甲基红等的阳性反应， 硝酸盐还原反应， 血糖酶的生成量等的测试都能够区别美人鱼法官 杆菌美人鱼亚种和杀鱼亚种， 但这些生理生化特征在不同的菌株中存在差异， 作为鉴别指 标极不稳定； 也有文献报道， 用飞行质谱法区分该亚种， 但这种 方法费时费力， 并且对仪器 要求很高； 也有用尿素酶基因作为靶标去区分两亚种， 但有的美人鱼发光杆菌杀鱼亚种也 存在着尿素酶的基因， 导 致区分度不高。 发明内容 [0004]本发明要解决的技术问题是提供一种美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的检测方法， 以 解决目前常规方法检测不稳定、 区分度低的问题。 [0005]为解决上述问题， 本发明提供了一种美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的检测方法， 包 括以下步骤： [0006]S1： 将待测样本的DNA提取； [0007]S2： 基于美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的cyclic  di‑GMP phosphodiesterase基因 序列作为检测靶序列， 以其种间及亚种间变异区设计1对种特异引物P1与P2， 所述P1与P2的 序列如下： [0008]上游引物P1:5'T TGTACTAT TTTTAACAAACTTGGCTA 3'， [0009]下游引物P2:5'C CTAATGTTTGTAAGCGAGTTAGCG 3'； [0010]S3： 以待测样本的DNA为模板， 通过上游引物P1与下游引物P2对进行实时荧光PCR 扩增检测， 进行电泳分析， 即完成鉴定 。 [0011]作为优选的方案， 所述步骤S1中， 所述将待测样本的DNA提取包括从美人鱼发光杆 菌美人鱼亚种的单菌落中提取DNA或 从待检鱼组织中提取DNA。 [0012]作为优选 的方案， 所述从美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的单菌落中提取DNA包括以说　明　书 1/4 页 3 CN 115109858 A 3