(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210610201.8 (22)申请日 2022.05.31 (71)申请人 西藏自治区人民政 府驻成都办事处 医院 地址 610000 四川省成 都市洗面 桥横街20 号 (72)发明人 孔清泉　李峰　柯博文　冯品　 (74)专利代理 机构 北京领科知识产权代理事务 所(特殊普通 合伙) 11690 专利代理师 徐丹丹　张丹 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/32(2006.01) (54)发明名称 一种结核分枝杆菌的检测方法及应用 (57)摘要 本 发 明 提 供 了 一 种 结 核 分 枝 杆 菌 (Mycobacterium  tuberculosis)的检测方法， 利 用特异性引物扩增结核分枝杆菌IS6110序列， 扩 增子中嵌入核酸嵌入染料， 加入包含显色底物的 纤维素纸中， 通过激发光使显色底物显色， 从而 能够根据显色结果对 核酸进行定量。 权利要求书2页 说明书10页 序列表2页 附图4页 CN 115466796 A 2022.12.13 CN 115466796 A 1.一种结核分枝杆菌(Mycobacterium  tuberculosis)的检测方法， 其特征在于， 所述 的检测方法包括： 1)获得核酸； 2)使核酸和核酸嵌入染料相接触， 获得混合物； 3)使混合物设置 于纸层的上样区， 并使混合物通过纸层的测试区； 4)读取测试 结果。 2.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 所述的核酸为通过PCR、 qPCR、 LAMP或 RPA扩增获得； 优选的， 所述的核酸 为双链DNA。 3.根据权利要求2所述的检测方法， 其特征在于， 所述扩增的引物为下列任一组、 两组 或三组的组合： A)上游引物： ACTAGC CGAGACGATCA A(SEQ ID NO： 1)， 下游引物： GTGAGTC CGGAGACTCTC(SEQ  ID NO： 2)； B)上游引物： TCGC CGCAGTACTG GTAGACATCGAG GATGTCGAGT TG(SEQ ID NO： 3)， 下游引物： ACTCGAG GCTGCCTACTACGTGATCTGAGAC CTCAGCC(SEQ ID NO： 4)； C)上游引物： CGATG GTTGAACCAGTCGA(SEQ  ID NO： 5)， 下游引物： CTCA ACGCCAGAGACCAG(SEQ ID NO： 6)。 4.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 所述核酸嵌入染料包括SYBR  Green  1、 PicoGre en、 硫代黄酮T或噻 唑橙。 5.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 所述的纸层为纤维素纸， 优选的， 所述 的纸层的测试区具有显色底 物的图层或沉积层； 优选的， 所述的显色底 物包括3,3' ,5,5'‑四甲基联 苯胺和/或邻苯二胺。 6.根据权利要求5所述的检测方法， 其特征在于， 所述的检测方法还包括激发光催化显 色底物发生光敏氧化， 并进 而产生颜色改变。 7.根据权利要求6所述的检测方法， 其特征在于， 所述的检测方法还包括根据显色底物 的显色结果定量分析核酸的含量或浓度， 优选 显色的颜色迁移的距离 定量检测核酸。 8.FLASH显色纸芯片在制备诊断和/或治疗结核病的产品中的应用。 9.根据权利 要求8所述的应用， 其特征在于， 所述的FLASH显色纸芯片包括纸层， 所述的 纸层为纤维素纸； 所述的纸层包括上样区和测试区， 所述的测试区具有显色底物的图层或 沉积层； 优选的， 所述的显色底 物包括3,3' ,5,5'‑四甲基联 苯胺和/或邻苯二胺。 10.根据权利 要求8或9所述的应用， 其特征在于， 所述的FLASH显色纸芯片包括底层、 中 间层和顶层， 优选的， 所述的底层为载玻片， 优选为硬纸板， 更优选为 塑料片， 更优选为 玻璃 片， 所述的中间层优选为双面胶， 更优选为石蜡膜， 所述的顶层为 纸层。 11.根据权利要求8 ‑10任一所述的应用， 其特征在于， 所述的产品包括FLASH显色纸芯 片以及下列任一组、 两组或三组的引物： A)上游引物： ACTAGC CGAGACGATCA A(SEQ ID NO： 1)， 下游引物： GTGAGTC CGGAGACTCTC(SEQ  ID NO： 2)； B)上游引物： TCGC CGCAGTACTG GTAGACATCGAG GATGTCGAGT TG(SEQ ID NO： 3)，权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115466796 A 2下游引物： ACTCGAG GCTGCCTACTACGTGATCTGAGAC CTCAGCC(SEQ ID NO： 4)； C)上游引物： CGATG GTTGAACCAGTCGA(SEQ  ID NO： 5)， 下游引物： CTCA ACGCCAGAGACCAG(SEQ ID NO： 6)。 12.一种结核分枝杆菌(Mycobacterium  tuberculosis)的检测试剂盒， 其特征在于， 所 述的检测试剂盒包 含下列任一组、 两组或三组的引物： A)上游引物： ACTAGC CGAGACGATCA A(SEQ ID NO： 1)， 下游引物： GTGAGTC CGGAGACTCTC(SEQ  ID NO： 2)； B)上游引物： TCGC CGCAGTACTG GTAGACATCGAG GATGTCGAGT TG(SEQ ID NO： 3)， 下游引物： ACTCGAG GCTGCCTACTACGTGATCTGAGAC CTCAGCC(SEQ ID NO： 4)； C)上游引物： CGATG GTTGAACCAGTCGA(SEQ  ID NO： 5)， 下游引物： CTCA ACGCCAGAGACCAG(SEQ ID NO： 6)。 13.根据权利要求12所述的检测试剂盒， 其特征在于， 所述的检测试剂盒中还包含PCR、 qPCR、 RPA和/或LAMP所需试剂， 优选还 包含核酸提取所需试剂。 14.根据权利要求12或13所述的检测试剂 盒， 其特征在于， 所述的检测试剂盒中还包含 核酸嵌入染料， 优选还 包含检测带； 所述核酸嵌入染料优选包括SYBR  Green 1、 PicoGre en、 硫代黄酮T或噻 唑橙； 所述的检测带包含纸层， 所述的纸层为纤维素纸； 所述的纸层包括上样区和测试区， 所 述的测试区具有显色底 物的图层或沉积层； 所述的显色底 物优选包括3,3' ,5,5'‑四甲基联 苯胺和/或邻苯二胺。 15.根据权利要求14所述的检测试剂盒， 其特征在于， 所述的检测带包括底层、 中间层 和顶层， 优选的， 所述的底层为载玻片， 优选为硬纸板， 更优选为塑料片， 更优选为玻璃片， 所述的中间层优选为双面胶， 更优选为石蜡膜， 所述的顶层为 纸层。 16.一种检测或扩增结核分枝杆菌(Mycobacterium  tuberculosis)的引物， 其特征在 于， 所述的引物包 含下列任一组、 两组或三组： A)上游引物： ACTAGC CGAGACGATCA A(SEQ ID NO： 1)， 下游引物： GTGAGTC CGGAGACTCTC(SEQ  ID NO： 2)； B)上游引物： TCGC CGCAGTACTG GTAGACATCGAG GATGTCGAGT TG(SEQ ID NO： 3)， 下游引物： ACTCGAG GCTGCCTACTACGTGATCTGAGAC CTCAGCC(SEQ ID NO： 4)； C)上游引物： CGATG GTTGAACCAGTCGA(SEQ  ID NO： 5)， 下游引物： CTCA ACGCCAGAGACCAG(SEQ ID NO： 6)。 17.一种分子诊断系统， 其特征在于， 所述的分子诊断系统包含权利要求16所述的引物 和检测带， 还 包括PCR、 qPCR、 RPA和/或LAMP的仪器， 还 包括光源； 优选的， 所述的检测带包含纸层， 所述的纸层为纤维素纸； 优选的， 所述的纸层包括上 样区和测试区， 所述的测试区具有显色底 物的图层或沉积层。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115466796 A 3