(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210754901.4 (22)申请日 2022.06.29 (71)申请人 浙江省园林植物与花 卉研究所 （浙 江省萧山棉麻研究所） 地址 311251 浙江省杭州市萧 山区临浦镇 王村村王村508号 申请人 广州市林业和园林科 学研究院 (72)发明人 周琴　刘国锋　史杰玮　马广莹　 包满珠　 (74)专利代理 机构 北京中济纬天专利代理有限 公司 11429 专利代理师 邓佳 (51)Int.Cl. C07K 14/415(2006.01) C12N 15/29(2006.01)C12N 15/11(2006.01) C12N 15/10(2006.01) C12N 15/113(2010.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 15/84(2006.01) C12N 15/66(2006.01) A01H 5/02(2018.01) A01H 6/20(2018.01) A01H 6/82(2018.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种矮牵牛PhSPL2、 rPhSPL2转录因子及其 应用 (57)摘要 本发明提出了一种矮牵牛PhSPL2、 rPhSPL2 转录因子及其应用， 属于基因工程技术领域， 所 述矮牵牛PhSPL2转录因子核苷酸序列如SEQ  ID  NO.1所示， 编码蛋白的氨基酸序列如SEQ  ID  NO.2所示。 所述矮牵牛PhSPL2转录因子对应的 miR156/15 7靶位点进行点突变后获得rPhSPL2转 录因子核苷酸序列如SEQ  IDNO.3所示， 编码蛋白 的氨基酸序列如SEQ  ID NO.4所示。 本发明得到 转基因植株PhSPL2、 rPhSPL2和amiRNA ‑PhSPL2， 对转基因植株进行分子鉴定和表型观 察， 以评估 该基因在调控植物开花和花器官大小的应用前 景。 权利要求书2页 说明书8页 序列表7页 附图5页 CN 114957424 A 2022.08.30 CN 114957424 A 1.一种矮牵牛PhS PL2转录因子， 其特 征在于， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示。 2.如权利 要求1所述矮牵牛PhSPL2转录因子的编码蛋白， 其特征在于， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO.2所示。 3.制备如权利 要求1所述的矮牵牛PhSPL2转录因子所使用的引物对， 其特征在于， 所述 引物对为全长扩增引物， 分别由上游引物PhS PL2‑F和下游引物PhS PL2‑R组成， 其中： 上游引物PhS PL2‑F的核苷酸序列如SEQ  ID NO.5所示； 下游引物PhS PL2‑R的核苷酸序列如SEQ  ID NO.6所示。 4.一种矮牵牛rPhSPL2转录因子， 其特征在于， 所述rPhSPL2转录因子由权利要求1所述 PhSPL2转录因子的miR 156/157靶位 点突变后得到， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示。 5.如权利要求4所述矮牵牛rPhSPL2转录因子的编码蛋白， 其特征在于， 其氨基酸序列 如SEQ ID NO.4所示。 6.制备如权利要求4所述的矮牵牛rPhSPL2转录因子所使用的引物对， 其特征在于， 所 述引物对为部 分扩增引物和全长扩增引物， 部 分扩增引物分别由第一段上游引物rPhSPL2 ‑ F1、 下游引物rPhSPL2 ‑R1和第二段上游引物rPhSPL2 ‑F2、 下游引物rPhSPL2 ‑R2组成； 全长扩 增引物由上游引物 rPhSPL2‑F1和下游引物 rPhSPL2‑R2组成， 其中： 上游引物 rPhSPL2‑F1的核苷酸序列如SEQ  ID NO.7所示； 下游引物 rPhSPL2‑R1的核苷酸序列如SEQ  ID NO.8所示； 上游引物 rPhSPL2‑F2的核苷酸序列如SEQ  ID NO.9所示； 下游引物 rPhSPL2‑R2的核苷酸序列如SEQ  ID NO.10所示。 7.一种利用权利要求3和6所述引物对获得转录因子的方法， 其特征在于， 包括以下步 骤： 以矮牵牛不同组织cDNA为模板和权利 要求3或6所述的引物对， 进行PCR扩增， 纯化得到 转录因子； 其中， PCR体系： PCR的条件： 98℃预变性， 2min； 98℃， 10s， 55℃， 15s， 72℃， 1min， 35个循环； 72℃延伸， 10min。 8.一种重组表达载体， 其特征在于： 所述重组表达载体含有权利要求1和/或4所述转录 因子的植物 表达载体， 其中， 所述 植物表达载体为pCAMBIA 2300。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114957424 A 29.一种权利要求8所述重组表达载体的构建方法， 其特征在于： 包括以下步骤： 将目的 片段分别导入克隆载体 18‑T中 ， 然后进行将含目的基因的克隆载体 18‑T和/或 18‑T与pCAMBIA2300用Sal  I和Kpn I双酶切 进行酶切， 再将得到的目的片段分别 连接到酶切过的pCAMBIA2300载体上即得到重组表达 载体pCAMBIA 2300‑PhSPL2和/或pCAMBIA 2300‑rPhSPL2。 10.一种权利要求8所述重组表达载体的构建方法， 其特征在于： 包括以下步骤： 利用 microRNA抑制技术， 以PhSPL2编码区序列为模板， 与将要干涉的片段， 并合成特异引物， 上 游引物amiRNA ‑PhSPL2‑F的核苷酸序列如SEQ  ID NO.11所示， 下游引物为amiRNA ‑PhSPL2‑R 的核苷酸序列如SEQ  ID NO.12所示； 扩增获得amiRNA ‑PhSPL2茎环结构序列， 随后连入B/C 中间载体； 将载有amiRNA ‑PhSPL2茎环结构序列的B/C中间载体用KpnI和SalI限制性内切酶 进行酶切， 目的片段连接至pCAMBIA2300载体的相应位点即得到重组表达载体 pCAMBIA2300‑amiRNA‑PhSPL2。 11.一种含有权利要求8所述重组表达载体的宿主细胞， 其特征在于： 所述宿主细胞为 农杆菌GV3101和AGL0 。 12.下述各项之一在促进植物开 花和花器官 大小的应用， 其特 征在于： 它包括 (1)权利要求1所述的PhS PL2和/或权利要求 4所述的rPhS PL2转录因子； (2)权利要求1所述的PhS PL2的干涉 载体amiRNA ‑PhSPL2； (3)权利要求8所述的重组表达载体； (4)权利要求1 1所述的宿主细胞。 13.根据权利要求12所述的应用， 其特 征在于： 所述 植物为拟南芥和矮牵牛。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114957424 A 3