(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210593148.5 (22)申请日 2022.05.27 (71)申请人 浙江海洋大学 地址 316000 浙江省舟山市定海区临城街 道海大南路1号 (72)发明人 祁鹏志　陈星潞　严小军　郭宝英　 司喜瑞　任中杰　李亚茹　贺湖客　 (74)专利代理 机构 北京卓胜佰达知识产权代理 有限公司 16 026 专利代理师 陈桂兰 (51)Int.Cl. C12Q 1/6851(2018.01) C12Q 1/6888(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种监测海 洋环境神经性毒物污染的方法 (57)摘要 本发明涉及海洋污染物 监测技术领域， 尤其 涉及一种监测海洋环境神经性毒物污染的方法。 将贻贝移植到海洋监控区域， 定期采集贻贝， 提 取鳃组织总RNA， 逆转录得到cDNA； 以贻贝GAPDH 基因为内参， 利用荧光定量PCR法检测McAchE   mRNA的表达量变化， 以此表示海域环境神经性毒 物的污染状况， 实现了海域污染物的实时监测。 权利要求书1页 说明书4页 序列表5页 附图1页 CN 114854836 A 2022.08.05 CN 114854836 A 1.一种监测海洋环境神经性毒物污染的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 将贻贝移植到海洋监控区域， 定期采集贻贝， 提取鳃组织的总RNA， 逆转录得到cDNA； 以 贻贝GAPDH基因为内参， 利用荧光定量PCR法检测McAchE  mRNA的表达量变化， 以此表示海域 环境神经性毒物的污染状况。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特 征在于， 所述贻贝为厚壳贻贝。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述贻贝浸在2米以下的海水中， 用浮球悬 浮， 下方用锚固定 。 4.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 以无污染条件下养殖的厚壳贻贝作为对 照， 对比监测海域贻贝M cAchE的表达变化。 5.根据权利 要求1所述的方法， 其特征在于， 所述McAchE荧光定量PCR的引物如序列SEQ   ID NO.3‑4所示。 6.根据权利 要求1所述的方法， 其特征在于， 所述内参GAPDH荧光定量PCR的引物如序列 SEQ ID NO.5‑6所示。 7.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 监测海域所采集的贻贝需和对照组贻贝在 同一温度水平。 8.根据权利 要求1所述的方法， 其特征在于， 所述McAchE表达水平显著升高时表示处于 污染初期或污染程度较低， 显著降低时表示污染程度较重， 需要立即加以控制。 9.根据权利 要求1所述的方法， 其特征在于， 运用最小二乘法2–ΔΔCt法处理qPCR数据， 利 用SPSS软件对数据进行分析， 采用单因子方差分析显著性差异。 10.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 采用序列SEQ  ID NO.7‑12所示的三对引 物扩增所述cDNA， 获得厚壳贻贝乙酰胆碱酯酶Ac hE基因全长 cDNA序列。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114854836 A 2一种监测海洋环境神经性毒物污染的方 法 技术领域 [0001]本发明涉及海洋污染物监测技术领域， 尤其涉及 一种监测海洋环境神经性毒物污 染的方法。 背景技术 [0002]有机磷和氨基甲酸酯类等广谱杀虫剂的发明极大的保证了农作物免受害虫侵害， 提高了农作物的安全性。 但越来越多的研究证明了这些杀虫剂对环境的危害性。 一旦通过 河流汇入海洋， 对海洋生物产生神经性毒害。 监测有机磷和氨基甲酸酯类等广谱杀虫剂的 污染状况 是当前海洋环境 监测的重要一环。 [0003]常用的监测方法是采集水样， 然后通过GC ‑MS鉴定污染物并分析含量。 此方法程序 繁琐、 工作量大、 对仪器设备条件要求高， 缺乏时效性。 利用海洋生物标志物进行污染监测 近年来在世界沿海国家普遍兴起， 不仅能够有效监测污染状况， 还能在一定程度反映出污 染的生物学效应， 是环境 监测行之有效的手段之一。 发明内容 [0004]为克服以往监测过程费时费力且滞后的缺点， 本发明提供了一种监测海洋环境神 经性毒物污染的方法， 实现实时有效监测海洋环境中的神经性毒物。 [0005]本发明的技 术方案如下： [0006]本发明提供了一种监测海洋环境神经性毒物污染的方法， 包括以下步骤： [0007]将贻贝移植到海洋监控区域， 定期采集贻贝， 提取鳃组织的总RNA， 逆转录得到 cDNA； 以cDNA为模板， 设计引物扩增得到贻贝McAchE基因序列， 以贻贝GAPDH基因为内参， 利 用荧光定量PCR法检测McAchE  mRNA的表达量变化， 以此表 示海域环 境神经性毒物的污染状 况。 [0008]优选的， 所述贻贝为厚壳贻贝。 [0009]优选的， 所述贻贝浸在2米以下的海水中， 用浮球悬浮， 下 方用锚固定 。 [0010]优选的， 以无污染条件下养殖的厚壳贻贝作为对照， 对比监测海域贻贝McAchE的 表达变化。 [0011]优选的， 所述M cAchE荧光定量PCR的引物如序列SEQ  ID NO.3‑4所示。 [0012]优选的， 所述内参GAP DH荧光定量PCR的引物如序列SEQ  ID NO.5‑6所示。 [0013]进一步的， 监测海域所采集的贻贝需和对照组贻贝在同一温度水平。 [0014]进一步的， 所述McAchE表达水平显著升高时表示处于污染初期或污染程度较低， 显著降低时表示污染程度较重， 需要立即加以控制。 [0015]优选的， 运用最小二乘法2–ΔΔCt法处理qPCR数据， 利用SPSS软件对数据进行分析， 采用单因子方差分析显著性差异。 [0016]优选的， 采用序列SEQ  ID NO.7‑12所示的三对引物扩增所述cDNA， 获得厚壳贻贝 乙酰胆碱酯酶Ac hE基因全长 cDNA序列。说　明　书 1/4 页 3 CN 114854836 A 3