(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211172918.5 (22)申请日 2022.09.26 (71)申请人 云南省农业科 学院生物技 术与种质 资源研究所 地址 650000 云南省昆明市盘龙区北京路 延长线2238号 (72)发明人 张仲凯　郑宽瑜　魏治镭　苏晓霞　 次仁措姆 　吴阔　巴宗　刘玉莹　 熊智琦　郑雪　 (74)专利代理 机构 北京挺立专利事务所(普通 合伙) 11265 专利代理师 高福勇 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/686(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种番茄单粒种子携带番茄斑萎病毒TSWV 的RT-PCR检测方法及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种番茄单粒种子携带番茄 斑萎病毒TSWV的RT ‑PCR检测方法及其应用。 包 括 如下步骤： (1)种子样品前处理： 将单粒番茄种子 放入离心管， 放入钢珠， 液氮速冻后使用全自动 组织研磨仪进行批量研磨处理； (2)RNA提取； (3) RT‑PCR检测。 本发明针对番茄单粒种子携带TSWV 病毒的RT‑PCR检测的方法， 检测结果真实可靠， 可以精确计算番茄种子的带毒率， 为番茄种子携 带TSWV病毒的快速检测及科学防控提供技术支 持。 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 115386652 A 2022.11.25 CN 115386652 A 1.一种番茄单粒种子携带番茄斑萎病毒TSWV的RT ‑PCR检测方法， 其特征在于包括如 下 步骤： (1)种子样 品前处理： 将单粒番茄种子放入离心管， 液氮速冻， 放入钢珠， 液氮速冻后 使用全自动组织研磨仪进行批量研磨处 理； (2)RNA提取； (3)RT ‑PCR检测。 2.根据权利要求1所述的番茄单粒种子携带番茄斑萎病毒TSWV的RT ‑PCR检测方法， 其 特征在于： 在步骤(1)中， 种子样品前 处理： 将单粒番茄种子放入1.5 mL离心管， 液氮速冻， 放 入1～2颗5 mm灭菌处理的钢珠， 液氮速冻后使用全自动组织研磨仪进 行批量研磨处理； 研磨 仪设置频率 为60HZ， 研磨时间为2 ～3min。 3.根据权利要求1所述的番茄单粒种子携带番茄斑萎病毒TSWV的RT ‑PCR检测方法， 其 特征在于： 在步骤(2)中， 研磨好的样品中加入1mL  TRIzol试剂后用常规TRIzol试剂法提取 病毒RNA， 或使用植物RNA提取 试剂盒按照使用说明书提取的总RNA用于RT ‑PCR分子检测。 4.根据权利要求1所述的番茄单粒种子携带番茄斑萎病毒TSWV的RT ‑PCR检测方法， 其 特征在于： 在步骤(3)中， 将总RNA在65℃条件下变性处理5min， 后加入5 ×Easy Quick RT  Master Mix 2 μL， RNA Template  6 μL， RNase ‑Free Water 2 μL， 配制成10 μL 反应体系进行反 转录， 反转录条件为37℃孵育15分钟， 85℃孵育5秒钟； 反转录后使用2 ×Taq Master Mix (康为， 中国)进行PCR反应， PCR扩增的引物为： TSWV  N‑F： 5′ ‑ATGTCTAAGGTTAAGCTCA CTAAGG‑ 3′， TSWV N‑R： 5′ ‑TTAAGCAAGTTCTGCAAGTTTTGTC‑3′。 5.根据权利要求1所述的番茄单粒种子携带番茄斑萎病毒TSWV的RT ‑PCR检测方法， 其 特征在于： 在步骤(3)中， 扩增目的片段大小 为777bp， 反应体系为20 μL， 2 ×Taq Master Mix  10 μL， cDNA  template 3 μL， RNase ‑Free Water 6 μL， TSWV  N‑F 0.5 μL， TSWV  N‑R 0.5 μL； 预 变性温度98℃， 时间10s； 变性温度98℃， 时间10s； 退火温度55℃， 时间40s； 延伸温度72℃， 时间30s； 30循环； 终止延伸温度72℃， 时间5mi n。 6.权利要求1所述的番 茄种子携带番 茄斑萎病毒 TSWV的带毒率检测中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115386652 A 2一种番茄单粒种子携 带番茄斑萎病毒TSW V的RT‑PCR检测方 法 及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及农业技术领域， 具体涉及一种番茄单粒种子携带番茄斑萎病毒TS WV的 RT‑PCR检测方法及其应用。 背景技术 [0002]番茄斑萎病毒(Tomato  spotted wilt orthotospovirus， TSWV)属于布尼亚病毒 目 (Bunyavirales) 番茄斑萎病毒科 (Tospoviridae)正番茄斑萎病毒属 (Orthotospovirus)。 该病毒于1915年首次在澳大利亚发现报道， 目前在世界范围内广泛分 布， 已被列为世界上危害最大的十种植物病毒之一， 每年造成全球约10亿美元的作物损失。 1989年TSWV病毒被欧洲及地中海植物保护组织(European  and Mediterranean   PlantProtection  Organization， EPPO)列入A2 类检疫性有害生物。 2006年中国将 TSWV列入 新公布的全国农业 植物检疫性有 害生物名单中。 [0003]据统计， 目前番茄斑萎病毒已在中国18个省、 市、 自治区番茄主产区发生流行， 成 为番茄上一种重要的病毒病害。 TSWV在番茄苗期可引起植株叶片黄斑、 坏死及紫脉， 整株萎 焉及坏死， 后期可引起番 茄果实产生黄斑、 环斑或坏死斑， 严重影响果实产量及质量。 [0004]目前发现番茄斑萎病毒可通过传毒介体昆虫蓟马(Thrips)以持久增 殖方式进行 传播。 能传播番茄斑萎病毒的蓟马主要有： 西花蓟马(Frankliniella  occidentalis)、 花蓟 马(F.intonsa)、 烟蓟马(Thrips  tabaci)和棕榈蓟马(T.palmi)等。 但除此之外， 本研究团 队经研究证实， TSWV可通过种子携带病毒进 行传播， 并且通过对TSWV流行病学的研究， 发现 种子带毒是一个非常重要的初侵染源。 [0005]种子带毒是TSWV远距离传播的重要途径。 带毒种子在田间作为初侵染源， 通过介 体因素进 行二次传播， 进而造成严重损失。 因此， 建立健全番茄斑萎病毒的种子病毒检测方 法， 对种子上的番茄斑萎病毒进行快速、 灵敏及准确的检测鉴定， 准确、 高灵敏度的鉴定检 测， 对于从源头上控制该病毒的扩散蔓延具有重要的指导 意义。 [0006]早期的病毒检测主要以生物学鉴定及电镜检测技术为主。 生物学鉴定存在耗时 长、 工作量大， 准确性低的问题。 电镜检测可直观地观察病毒的形态、 大小、 表面结构等。 但 对设备条件要求高， 需专业人员操作， 不适合于大规模检测。 血清学检测是一种快速、 应用 范围交广的检测技术。 其中应用最广泛的是酶联免疫吸附法(ELISA)， 其原理基于抗原 ‑抗 体特异性结合的免疫反应， 再进一步通过显色底物进 行显色反应进而判断样品中是否含有 抗原。 血清检测具有操作简单、 快速、 特异性强等特点。 RT ‑PCR是基于聚合酶链式反应的一 种体外DNA扩增技术， 其原理是通过反转录酶将病毒RNA反转录成cDNA， 进一步通过聚合酶 链式反应， 以cDNA为模板， 加入引物及4种脱氧核苷酸， 在DNA聚合酶的酶促条件下， 复制出 大量特定基因片段。 RT ‑PCR是从核酸水平检测病毒， 具有准确、 灵敏、 快速等特点。 [0007]目前， 尚缺乏快速精确检测番 茄单粒种子携带番 茄斑萎病毒的分子检测方法。说　明　书 1/4 页 3 CN 115386652 A 3