(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210935696.1 (22)申请日 2022.08.04 (71)申请人 江苏省家禽科 学研究所 地址 225125 江苏省扬州市邗江区仓颉路 58号 (72)发明人 贾晓旭　高玉时　唐修君　樊艳凤　 陆俊贤　张静　刘茵茵　马丽娜　 马尹鹏　黄胜海　陈大伟　葛庆联　 周倩　唐梦君　张小燕　付胜勇　 汪克宝　顾荣　 (74)专利代理 机构 南京天华专利代理有限责任 公司 32218 专利代理师 杜静　徐冬涛 (51)Int.Cl. C12Q 1/6879(2018.01)C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种用于鸸鹋性别鉴定的PCR引物、 试剂盒 及其方法 (57)摘要 本发明提供一种用于鸸鹋性别鉴定的PCR引 物、 试剂盒及其方法， 通过本发明的PCR引物进行 PCR扩增和毛细管电泳， 利用毛细管电泳结果的 峰数来确定鸸鹋的性别， 具有操作简单方便， 鉴 别结果快速准确， 便于基层推广和使用， 具有广 阔的市场应用前景， 此外， 基于本发明方法开发 的检测试剂盒， 可产生可观的经济效益和良好的 社会价值。 权利要求书1页 说明书3页 附图7页 CN 115232868 A 2022.10.25 CN 115232868 A 1.一种性别鉴定用PCR引物， 其特 征在于， 所述引物如下： 正向引物： 5' ‑AGCATGTG GCAGAGGTA‑3'； 反向引物： 5' ‑TGATGATG GCATTGGAC‑3'。 2.根据权利要求1所述的PCR引物， 其特 征在于， 所述引物5 ’端加有FAM荧 光标记。 3.包含权利要求1或2所述的性别鉴定用PCR引物的试剂盒。 4.根据权利要求3所述的试剂盒， 其特征在于， 所述的试剂盒还包含PCR反应液和/或 DNA提取液。 5.权利要求1或2所述的PCR引物或权利要求3或4所述的试剂盒在鸸鹋性别鉴定 中的应 用。 6.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于， 通过权利要求1或2所述的PCR引物或权利 要求3或4所述的试剂盒进行PCR扩增， 电泳结果呈现272bp一个峰 的为公鸸鹋， 呈现272b p和 282bp的两个峰时为母鸸鹋。 7.一种鸸鹋的性别快速鉴定方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 1)提取待测鸸鹋的基因 组DNA； 2)以步骤1)中提取的DNA为模板， 利用权利要求1或2所述引物对或权利要求3或4所述 的试剂盒， 进行PCR扩增反应； 3)PCR产物进行毛细管电泳检测， 电泳结果呈现272bp一个峰的为公鸸 鹋， 呈现272bp和 282bp的两个峰的为母鸸鹋。 8.根据权利要求7所述的鉴定方法， 其特征在于， 步骤1)提取待测家禽的基因组DNA选 用羽毛、 血 液、 组织或器官进行基因 组DNA的提取。 9.根据权利要求7所述的鉴定方法， 其特征在于， 步骤2)中PCR反应体系为： 2 ×PCR Mix  25 μL， 10 μmo l/L正向和反向引物各1 μL， 5 0‑100 μg/ml模板DNA  2 μL， 超纯 水21 μL。 10.根据权利 要求7所述的鉴定方法， 其特征在于， 步骤2)中PCR反应程序 为： 95℃5min， 即95℃30s， 60℃30s， 72℃3 0s， 35循环， 72℃10mi n。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115232868 A 2一种用于鸸 鹋性别鉴定的PCR引物、 试剂盒及其方 法 技术领域 [0001]本发明属于生物技术领域， 具体涉及一种用于鸸鹋性别鉴定的PCR引物、 试剂盒及 其方法。 背景技术 [0002]鸸鹋原产于澳大利亚， 浑身都是宝， 肉质鲜美， 皮柔韧、 美丽、 透气性好， 蛋可以用 来雕刻成工艺品， 具有较高的养殖经济价值。 鸸鹋适应能力比较强， 在我国已经有了一定的 养殖面积。 鸸鹋的初生时， 很难确定幼鸟的性别， 要到接近性 成熟时， 才能凭经验进 行鉴别。 目前鸸鹋已经可以人工授精， 需要的母鸸鹋的数量要远远大于公鸸鹋的数量。 因此， 早期确 定鸸鹋的性别非常重要， 可以提前将不需要的公鸸鹋淘汰掉， 提高养殖效益。 [0003]鸟类的性别是由染色体决定的， 其性别决定方式为ZW型， 雄鸟有一对Z染色体， 而 雌鸟则是一个Z染色体和一个W染色体。 染色体螺旋蛋白基因(Chromo  helicase DNA ‑ Binding gene,CHD)为鸟类W染色体第一个功能性基因， CHD基因在非平胸鸟类  (除鸸鹋、 鸵 鸟以外的大部分鸟类)有两个同源拷贝CHD ‑Z和CHD‑W， 分别为Z连锁和W连锁， 两个拷贝的内 含子序列大小有很大差别， 可以进行性别鉴定。 鸸鹋等平胸鸟类Z染色体和W染色体的上 的 基因高度同源， 现有技 术无法根据 序列长度的差异进行性别鉴定 。 [0004]虽然有研究利用Z染色体和W染色体上同源基因的碱基突变位点不同进行鸸鹋的 性别鉴定， 如： 付晶等建立的方法(付晶,白秀娟.鸸鹋性别鉴定的分子标记方法[J].东北农 业大学学报,2010,41(6):85 ‑89)， 设计一对引物， 在雄性鸸鹋中不能扩增出片段， 雌性鸸鹋 中能扩增出1条片段。 Koshiishi等建立的方法， 设计3条引物， 在雄性鸸鹋扩增出1条片段， 雌性鸸鹋中能扩增出2条片段。 (Koshiishi  Y,Wada K.A simplified  protocol  for molecular  sexing in the emu(Dromaius  novaehollandiae).Poult  Sci.2018； 97(4): 1117‑1119.)。 但 这些方法极易产生假阴性， 如： 付晶等方法中， 扩增不出来有可能是样本本 身是雄性， 也有可能是PCR本身的问题。 Koshiishi等方法中， 3条引物两两结合本身就存在 竞争关系， 扩增出1条片段可能是样 本本身是雄性， 也有 可能PCR本身的问题， 另外一条片段 没扩增出来， 导 致错判。 [0005]随着我国鸸鹋产业的快速发展， 亟需开发一种简单方便， 能够快速、 准确鉴别鸸鹋 性别的方法。 发明内容 [0006]本发明目的在于解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足， 提供一种设计合 理， 可用于鸸鹋早期性别快速鉴定的PCR引物。 [0007]本发明通过以下技 术方案实现本发明的目的： [0008]本发明目的之一在于提供一种性别鉴定用PCR引物， 所述引物序列如下所示。 即所 述引物的核苷酸序列为： [0009]正向引物： 5' ‑AGCATGTG GCAGAGGTA‑3'；说　明　书 1/3 页 3 CN 115232868 A 3