(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211206248.4 (22)申请日 2022.09.30 (71)申请人 潍坊医学院 地址 261053 山东省潍坊市潍城区宝通西 街7166号 (72)发明人 伊正君　付玉荣　李崇辉　王文涛　 张波　唐媛媛　曲梅花　 (74)专利代理 机构 北京汇捷知识产权代理事务 所(普通合伙) 11531 专利代理师 王文娇 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) (54)发明名称 一种用于 结核病诊断与鉴别的miRNA标志物 及试剂盒 (57)摘要 本发明属于诊断标志物 技术领域， 具体涉及 一种用于结核病诊断与鉴别的miRNA标志物及试 剂盒。 所述miRNA为如下3种miRNA的任意一种 或 任意组合， 名称和序列分别如下所示： miR ‑342‑ 3p， 其为SEQ  ID NO:1序列miR ‑199a‑3p， 其为SEQ   ID NO:2序列； miR ‑199b‑3p， 其为SEQ  ID NO:2序 列。 一种用于结核病诊断与鉴别的试剂盒， 所述 试剂盒包括miRNA标志物设计的引物。 本发明创 新发现外周血miR ‑342‑3p及miR‑199a/b‑3p的表 达组合物作为一个重要的诊断标志物， 为从分子 水平进行结核病血液学诊断提供了新方向， 具有 重要的理论价值和潜在应用价值。 肺癌和PTB的 高效能辅助诊断， 可辅助鉴别诊断单纯P TB与PTB 合并肺外结核、 单 纯PTB与PTB合并咯血。 权利要求书1页 说明书11页 序列表3页 附图5页 CN 115505635 A 2022.12.23 CN 115505635 A 1.一种用于结核病诊断与鉴别的miRNA标志物， 其特征是： 所述miRNA为如下3种miRNA 的任意一种或任意组合， 名称和序列分别如下 所示： miR‑342‑3p： UCUCACACAGA AAUCGCACCCGU， 其为SEQ ID NO:1序列； miR‑199a‑3p和miR‑199b‑3p： ACAGUAGUCUGCACAU UGGUUA， 其为SEQ ID NO:2序列。 2.根据权利要求1所述的用于结核病诊断与鉴别的miRNA标志物的应用， 其特征在于： 所述miRNA标志 物用于结核病诊断与鉴别。 3.一种用于结核病 诊断与鉴别的试剂 盒， 其特征在于： 所述试剂 盒包括根据权利要求1 所述的miRNA标志 物设计的引物。 4.根据权利要求3所述的用于结核病 诊断与鉴别的试剂 盒， 其特征在于： 所述引物包括 根据每个miRNA标志物设计的逆转录引物、 荧光定量反应的特异上游引物以及特异性下游 引物。 5.根据权利要求 4所述的用于结核病诊断与鉴别的试剂盒， 其特 征在于： 所述miR‑342‑3p逆转录引物序列如SEQ  ID NO:4所示， 荧光定量反应的特异上游引物 序列如SEQ  ID NO:5所示， 荧 光定量反应的特异下游引物序列如SEQ  ID NO:6所示； 所述miR‑199a‑3p和miR‑199b‑3p的逆转录引物序列如SEQ  ID NO:7所示， 荧光定量反 应的特异下游引物序列如SEQ  ID NO:10所示； 所述miR‑199a‑3p荧光定量反应的特异上游引物序列如SEQ  ID NO:8所示， 所述miR‑199b‑3p荧光定量反应的特异上游引物序列如SEQ  ID NO:9所示。 6.根据权利要求3所述的用于结核病 诊断与鉴别的试剂 盒， 其特征在于： 所述试剂 盒还 包括血浆RNA提取 液、 逆转录反应液、 荧 光定量PCR反应液、 内参引物。 7.根据权利要求6所述的用于结核病诊断与鉴别的试剂盒， 其特征在于： 所述内参为 U6: GUGCUCGCUUCGGCAGCACAUAUACUAAAAUUGGAACGAUACAGAGAAGAUUAGCAUGGCCCCUGCGCAAGG AUGACACGCA AAUUCGUGAAGCGUUCCAUAUUUUU,其为SEQ ID NO:3序列； 所述内参U6上游引物序列如SEQ  ID NO:11所示， 逆转录引物与下游引物如SEQ  ID NO: 12所示。 8.根据权利要求6所述的用于结核病诊断与鉴别的试剂盒， 其特 征在于： 所述血浆RNA提取液包括： Trizol ‑LS试剂、 三氯甲烷、 异丙醇、 75％乙醇、 无RNA酶水溶 液。 9.根据权利要求6所述的用于结核病 诊断与鉴别的试剂 盒， 其特征在于： 所述逆转录反 应液包括： 血浆 RNA、 5×反应缓冲液、 脱氧核糖核苷 三磷酸混合物、 核糖核酸酶抑制剂、 改良 逆转录酶、 无RNA酶水 溶液。 10.根据权利要求6所述的用于结核病诊断与鉴别的试剂盒， 其特征在于： 所述荧光定 量PCR反应液包括： TB Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)和无RNA酶水 溶液。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115505635 A 2一种用于结核病诊断与鉴别的miRNA标志物及 试剂盒 技术领域 [0001]本发明属于诊 断标志物技术领域， 具体涉及一种用于结核病诊 断与鉴别的miRNA 标志物及试剂盒。 背景技术 [0002]结核病是WHO重点控制的传染性疾病， 肺结核(Pulmonary  tuberculosis， PTB)的 早期诊断对于治疗和防止不 断传播十分重要。 当PTB病发生时， PTB患者可以作为活动性传 染源进行病原菌的播散， 不 断扩大感染人数。 此外， 结核病的早期诊断对于PTB患者的治疗 以及存活至关重要。 因此， PTB的早期鉴别诊断尤为重要。 [0003]目前的鉴别诊 断方法对于区分PTB与肺癌， 及PTB亚组存在各种不足。 目前临床应 用的主要诊断PTB的方法： [0004](1)痰液涂片： ①阳性率低： 约30％左右， 通常需5000—10000个菌/ml才可能获阳 性结果；②特异性差： 多种分枝杆菌均可着色， 需要进一步鉴定是否为结核分枝杆菌； ③无 法区别死菌与活菌； ④影响因素多： 受检验人员技术水平、 所收集痰液标本质量的影响。 综 上， 可致大量漏诊、 误诊。 (2)细菌培养： ①培养周期长(6 ‑8周)；②阳性率不高： 约30％ ‑40％ 左右；③需进一步鉴定才可确定是否为结核分枝 杆菌。 (3)结核菌素试验(PPD)： 主要问题是 高水平的假阳性结果， PPD阳性仅表 示曾有结核感染， 不代表现在患病， 同时PPD试验测量易 受多种因素影响， 如接种卡介苗等。 (4)结核菌抗原检测： ①抗体制备困难： 抗结核菌抗原的 高活性特异结核抗体制备非常 困难， 因此限制了该法的大量应用； ②抗体特异 性不够理想： 现有的研究用免疫动物的方法制成抗血清， 虽经纯化可获得高效价的结核菌抗体， 但其特 异性不高， 与非结核分枝杆菌、 乃至无亲缘关系的细菌也会出现交叉反应。 (5)γ ‑干扰素释 放检测(IGRA)： 价格昂贵， 难以普及， 且所述技术无法对PTB亚组进行特异、 灵敏的鉴别诊 断； (6)结核抗体检测： 灵敏性和特异性均不高。 基于上述问题， 开发新的诊断策略迫在眉 睫。 [0005]MicroRNAs(miRNAs)作为biomarker： miRNAs是一类新型的、 细胞内源性的单链非 编码小RNA， 在细胞增殖凋亡、 器官发育 分化、 疾病发展、 肿瘤形成等病理生理过程中发挥重 要调控作用。 近年来， 随着mi RNA的研究不断深入， 其在鉴别诊断疾病方面显示出的优势： ① miRNAs对于不同疾病具有高度特异性、 高度保守性； ②在血清或血浆等体液中存在的循环 miRNAs由于稳定性好， 在正常人外周血中表达稳定且 可以稳定存在， 无显著的个体差异； ③ 血液标本易于取得， 不易污染， 检测费用不高； 在作为生物标志物的应用领域具有巨大潜 力。 [0006]目前市场已存在商品化microRNA肺癌早期检测试剂盒产品。 但在PTB的鉴别诊断 方面， 仍有如下问题： 1.肺癌和PTB的鉴别诊断效能有待提升， 针对PTB的鉴别诊断， 其特异 性(75.0％)有待提高， 对诊断的准确性影响较大。 2.对于单纯PTB及其亚型的辅助诊断存在 局限性， 涉及到肺炎和慢性阻塞性肺病患者的鉴别， 无法对单纯肺结核及其亚型进 行分析； 3.标志分子组合数量较多， 成本较高； 4.样本分析量不大， 可能影响置信度。 因此， 找到一种说　明　书 1/11 页 3 CN 115505635 A 3