(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211095010.9 (22)申请日 2022.09.05 (71)申请人 广州华峰生物科技有限公司 地址 510730 广东省广州市经济技 术开发 区科学城揽月路8 0号广州科技创新基 地C区第4层401/40 3-405/409-411房 (72)发明人 熊槐　肖周婷　马春平　卢桂冰　 王国权　 (74)专利代理 机构 广州三环 专利商标代理有限 公司 44202 专利代理师 黄绮颖 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/77(2006.01) (54)发明名称 一种用于检测虾 苗镰刀菌的冻干PCR试剂及 应用其检测虾苗镰刀菌的方法 (57)摘要 本发明提供一种用于检测虾苗镰刀菌的冻 干PCR试剂， 包括Taq  DNA聚合酶、 上游引物、 下游 引物、 荧光标记探针、 冻干保护剂； 上游引物的核 苷酸序列为： 5＇ ‑GTCACGTCGAGCTTCCA TAGC‑3＇ ； 下 游 引 物 的 核 苷 酸 序 列 为 ：5 ＇ ‑ GAAGTTGGGGTTTAACGGCG ‑3＇ ； 荧光标记探针的核 苷酸序列为： 5＇ ‑TAGTAGTAAAACCCTCGTTACTGG ‑ 3＇ 。 本发明的冻干PCR试剂具有常温储存稳定性， 且利用其可以检测极低含量的镰刀菌， 可以快 速、 有效地检测虾苗中的镰刀菌 。 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 115521990 A 2022.12.27 CN 115521990 A 1.一种用于检测虾苗镰刀菌的冻干PCR试剂， 其特征在于， 包括Taq  DNA聚合酶、 上游引 物、 下游引物、 荧 光标记探针、 冻干保护剂； 所述上游引物的核苷酸序列为： 5＇ ‑GTCACGTCGAGCT TCCATAGC‑3＇ ； 所述下游引物的核苷酸序列为： 5＇ ‑GAAGTTGGGGTTTAACGGCG‑3＇ ； 所述荧光标记探针的核苷酸序列为： 5＇ ‑TAGTAGTA AAACCCTCGTTACTGG‑3＇ 。 2.如权利要求1所述用于检测虾苗镰刀菌的冻干PCR试剂， 其特征在于： 所述荧光标记 探针5＇ 端标记的荧 光报告基团包括FAM， 所述3＇ 端标记的荧 光猝灭基团包括MGB。 3.如权利 要求1所述用于检测虾苗镰刀菌的冻干PCR试剂， 其特征在于： 每管冻干PCR试 剂包括1‑20单位所述Taq  DNA聚合酶、 1 ‑20pmol所述上游引物、 1 ‑20pmol所述下游引物、 0.5‑10pmol所述荧光标记探针、 质量体积比为2 ‑15％的所述冻干保护剂。 4.如权利 要求4所述用于检测虾苗镰刀菌的冻干PCR试剂， 其特征在于： 每管冻干PCR试 剂包括7.5单位所述Taq  DNA聚合酶、 5pmol所述上游引物、 5pmol所述下游引物、 2.5pmol所 述荧光标记探针、 质量体积比为7.2％的所述冻干保护剂。 5.如权利要求1所述用于检测虾苗镰刀菌的冻干PCR试剂， 其特征在于： 所述冻干保护 剂包括海藻糖、 蔗糖、 葡萄糖、 岩藻糖、 山梨醇、 甘露醇、 右旋糖苷、 聚乙二醇中的至少一种。 6.一种如权利要求1所述用于检测虾苗镰刀菌的冻干PCR试剂的制备方法， 其特征在 于， 包括以下步骤： (1)将所述Taq  DNA聚合酶、 所述上游引 物、 所述下游引 物、 所述荧光标记探针、 所述冻 干保护剂混合； (2)将所得到的混合物进行冻干； 所述冻干的反应程序为 ‑45℃， 2h； ‑45℃， 20Pa， 2h； ‑45℃， 10Pa， 16 h； 25℃， 10Pa， 2h 。 7.一种检测虾苗镰刀菌的方法， 其特征在于： 采用 如权利要求1～5任一项所述用于检 测镰刀菌的冻干PCR试剂进行检测。 8.如权利要求7 所述检测虾苗镰刀菌的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： S1.提取待测虾苗的DNA； S2.利用复溶液将所述冻干PCR试剂复溶后， 以所述待测虾苗的DNA为模板， 进行PCR扩 增； S3.分析PCR扩增产物。 9.如权利要求8所述检测虾苗镰刀菌的方法， 其特征在于， 所述复溶液包括以下组分： 0.01‑0.2 μmol镁离子、 0.25 ‑2.5 μmol三羟甲基氨基甲烷、 0.25 ‑5 μmol钾离子、 0 ‑2％质量体 积比的非离 子型去污剂。 10.如权利要求9所述检测虾苗镰刀菌的方法， 其特征在于： 所述非离子型去污剂包括 曲拉通X‑100、 吐温20、 吐温80、 NP40中的至少一种。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115521990 A 2一种用于 检测虾苗镰刀菌的冻干PCR试剂及应用其检测虾苗 镰刀菌的方 法 技术领域 [0001]本发明属于生物检测技术领域， 具体涉及一种用于检测虾苗镰刀菌的冻干PCR试 剂及应用其检测虾苗镰刀菌的方法。 背景技术 [0002]镰刀菌病对于海水虾或淡水虾而言， 是较为常见的疾病之一， 尤其对越冬亲虾有 较高的感染率。 镰刀菌病病原包括腐皮镰刀菌(Fusarium  solani)、 尖孢镰刀菌(Fusarium   oxysporum)、 三线镰刀菌(Fusarium  tricinctum)和禾谷镰刀菌(Fusarium  carum)等， 主要 寄生于虾的鳃、 头胸甲、 附肢体壁和眼球等部位， 主要症状为感染部位变黑， 例如寄生于鳃 部时引起鳃组织坏死变黑， 有人称之为 “黑鳃病”， 但是该症状与由细菌引起的 “褐斑病”相 似， 很难从外观 症状进行区分。 [0003]现有的镰刀菌病的检测方法， 通常需要从病灶处取样然后借助显微镜等设备去进 行检测， 这种方法只能是在 对虾发病后才进 行检测， 操作过程繁琐， 而且灵敏度低无预警作 用。 因此， 开 发出一种可以在虾苗出现镰刀病症状之前即可快速检测到镰刀菌的方法， 使养 殖户有足够的时间做出相应的应对措施， 从而避免虾苗出现镰刀菌病症状， 具有十分重大 的实际意 义。 [0004]PCR技术是生物检测领域较为成熟的技术， 且在PC R技术中， 荧光定量PC R技术操作 步骤较为简易， 可以避免扩增产物引起的交叉感染， 减少假阳性的发生， 因此荧光定量PCR 在生物检测领域的应用极为广泛。 通常在荧光定量PCR技术中， 需采用冻干P CR试剂， 而冻干 PCR试剂对储存 条件苛刻， 常需要在较低温度下保存和运输， 成本较大。 因此， 制备一种可以 常温下储 存和运输的冻干PCR试剂， 具有较大的经济意 义。 发明内容 [0005]为了解决现有技术中的缺点和不足， 本发明提供一种用于检测虾苗镰刀菌的冻干 PCR试剂及应用其检测虾苗镰刀菌的方法， 以解决上述 技术问题中的至少一个。 [0006]根据本发明的第一个方面， 提供一种用于检测虾苗镰刀菌的冻干PCR试剂， 其特征 在于： 包括Taq  DNA聚合酶、 上游引物、 下游引物、 荧 光标记探针、 冻干保护剂； [0007]上游引物的核苷酸序列为： 5＇ ‑GTCACGTCGAGCT TCCATAGC‑3＇ ； [0008]下游引物的核苷酸序列为： 5＇ ‑GAAGTTGGGGTTTAACGGCG‑3＇ ； [0009]荧光标记探针的核苷酸序列为： 5＇ ‑TAGTAGTA AAACCCTCGTTACTGG‑3＇ 。 [0010]优选地， 荧光标记探针5＇ 端标记的荧光报告基团包括FAM， 3＇ 端标记的荧光猝灭基 团包括MGB。 [0011]对于虾苗镰刀菌的基因序列 进行全面分析后， 选择以虾苗镰刀菌5.8SrRNA基因保 守序列为靶标， 在此基础上设计和优化得到的引物和荧光标记探针具有合适的长度和特定 的碱基序列， 对镰刀菌有较好的特异性， 因而可以利用上述引物和荧光标记探针实现对镰说　明　书 1/4 页 3 CN 115521990 A 3