(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210579055.7 (22)申请日 2022.05.26 (71)申请人 安徽省农业科 学院植物保护与农产 品质量安全研究所 地址 230031 安徽省合肥市农科南路40号 (72)发明人 严丹侃　陈莹　王芳　马超　 韩科雷　胡淑珍　李婷　 (74)专利代理 机构 广州市华学知识产权代理有 限公司 4 4245 专利代理师 高宁馨 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/94(2006.01) (54)发明名称 一种用于检测中国南瓜曲叶病毒的RPA引 物、 探针、 试剂盒及检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种用于检测中国南瓜曲叶 病毒的RPA引物、 探针、 试剂盒及检测方法， 属于 生物安全技术领域。 RPA引物基于中国南瓜曲叶 病毒外壳蛋白基因序列设计的， RPA引物序列如 SEQ ID No:1和2所示； PRA探针根据RPA引物扩增 区域设计， 其序列大小为49  bp， 其5'端用FAM标 记， 3'端用C3 ‑Spacer修饰， 且在RPA探针的序列 中间距5'端的33bp处进行THF修饰。 本发明还提 供含有RPA引物和探针的试剂盒。 本发明进一步 提供基于RPA引物和探针建立的RPA 检测方法， 将 RPA技术应用到媒介昆虫烟粉虱体内的中国南瓜 曲叶病毒的分子检测， 其兼具特异性强、 灵敏度 高、 实用性好、 对仪器 设备要求较低的特点， 为中 国南瓜曲叶病毒的早期监控、 带毒烟粉虱的防治 和病毒病防治提供新方法。 权利要求书2页 说明书6页 序列表1页 附图2页 CN 114807447 A 2022.07.29 CN 114807447 A 1.一种用于检测中国南瓜曲叶病毒的RPA引物和RPA探针， 其特 征在于： 所述的RPA引物基于中国南瓜曲叶病毒外壳 蛋白基因序列设计， 所述的RPA引物的上游引物如SEQ  ID No:1所示， 所述的RPA引物的下游引物如SEQ  ID No:2所示；  所述的PRA探针根据所述 的RPA引物 扩增区域设计，  所述的RPA探针的序列大小为49  bp， 其5’端用FAM标记， 3 ’端用C3‑Spacer 修饰， 且在RPA探针的序列中间距5 ’端的33bp处进行THF修饰。 2.根据权利要求1所述的用于检测中国南瓜曲叶病毒 的RPA引物和 RPA探针， 其特征在 于： 所述的RPA引物的下游引物包括如SEQ  ID No:2所示的序列， 且其5 ’端用Biotin修饰；   所述的RPA探针包括如SEQ  ID No:3所示的序列， 其5 ’端用FAM标记， 3’端用C3‑Spacer修饰， 且在RPA探针的序列中间距5 ’端的33bp处进行THF修饰。 3.一种含有权利要求1或2所述的RPA引物和 RPA探针的用于检测中国南瓜曲叶病毒的 试剂盒。 4.根据权利要求3所述的试剂盒， 其特征在于： 所述的试剂 盒还包括RPA反应管、 阴性对 照模板、 阳性对照模板中的至少一种。 5.一种用于检测中国南瓜曲叶病毒的检测方法， 其特 征在于： 包括以下步骤： （1） 提取样品中的DNA； （2） 以步骤 （1） 提取的DNA作为待检测DNA模板， 采用权利要求1或2所述的RPA引物和RPA 探针， 在RPA反应管中进行RPA扩增反应； （3） 分析RPA扩增产物。 6.根据权利要求5所述的用于检测中国南瓜曲叶病 毒的检测方法， 其特征在于： 所述的 RPA引物和RPA探针的检出限为102 copies/ μL。 7.根据权利要求5所述的用于检测中国南瓜曲叶病毒的检测方法， 其特征在于： 步骤 （2） 中RPA扩增反应的反应 体系以50 μL计为： 待检测DNA模板                                      1.0 μL 10 μmol/L 权利要求1所述的RPA引物的上游引物          2.1 μL 10 μmol/L 权利要求1或2所述的RPA引物的下游引物       3 μL 10 μmol/L 权利要求1或2所述的RPA探针                 0.6 μL 反应缓冲液                                         29.4 μL RPA冻干粉                                          5.0mg 280mmol/L醋酸镁                                    2.5 μL ddH2O                                          补足至50 μL。 8.根据权利要求5所述的用于检测中国南瓜曲叶病毒的检测方法， 其特征在于： 步骤 （2） 中RPA扩增反应的反应条件为： 38℃下反应20分钟， 随后冰上终止反应。 9.根据权利要求5 ‑8任意一项所述的用于检测中国南瓜曲叶病毒的检测方法， 其特征 在于： 步骤 （3） 中分析RPA扩增产 物的方法包括如下步骤： 取RPA扩增产物与缓冲液混匀制备 混合液， 将试纸条上样区置于 混合液中， 4min ‑5min后观察并记录结果； 结果的判定如下： 若 试纸条的检测线位置出现条带， 而且质控线位置出现条带， 则表明该样品中含有中国南瓜权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114807447 A 2曲叶病毒， 若试纸条的仅质控线位置出现条 带， 则表明该样品中不含有中国南瓜曲叶病毒。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114807447 A 3