(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221074914 4.1 (22)申请日 2022.06.28 (71)申请人 广州市金圻睿生物科技有限责任公 司 地址 510000 广东省广州市黄埔区(国际生 物岛)螺旋四路9号第四层B401单元、 第五层B5 01单元、 第六层B6 01单元 (72)发明人 吴春求　朱鹏远　余成鹏　王杨　 邹树勇　陈嘉昌　柳俊　胡朝晖　 (74)专利代理 机构 北京品源专利代理有限公司 11332 专利代理师 王艳斋 (51)Int.Cl. C12Q 1/6806(2018.01) C40B 50/06(2006.01)C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12Q 1/689(2018.01) C12R 1/01(2006.01) C12R 1/19(2006.01) C12R 1/21(2006.01) C12R 1/22(2006.01) C12R 1/385(2006.01) C12R 1/43(2006.01) C12R 1/445(2006.01) C12R 1/46(2006.01) (54)发明名称 一种用于构建微生物靶向测序文库的引物 组合及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种用于构建微生物靶向测 序文库的引物组合及其应用。 所述引物组合包括 接头引物、 扩增引物和封闭引物， 本发明将接头 引物和扩增引物混合在一个反应中同时进行目 标区域扩增及 文库扩增， 同时， 加入封闭引物， 降 低接头引物和扩增引物所产生的引物 二聚体， 能 够在一个 反应管中实现文库的一步制备， 显著减 少操作步骤， 提高文库制备效率， 提升用户友好 性， 同时， 也避免气溶胶引起的实验污染， 为靶向 测序的应用提供 更为广阔的市场价 值。 权利要求书2页 说明书46页 序列表44页 附图1页 CN 115058490 A 2022.09.16 CN 115058490 A 1.一种用于构建微生物靶向测序文库的引物组合， 其特征在于， 所述引物组合包括接 头引物、 扩增引物和封闭引物； 所述接头引物包括第 一正向引物和第一反向引物， 所述第一正向引物从5 ’到3’端包括 依次相连的P5接头序列、 第一标签序列和公共序列， 所述第一反向引物从5 ’到3’端包括依 次相连的公共序列、 第二标签序列和P7接 头序列； 所述扩增引物包括第 二正向引物和第二反向引物， 所述第二正向引物从5 ’到3’端包括 依次相连的公共序列和微生物目标区域的正向引物， 所述第二反向引物从5 ’到3’端包括依 次相连的微 生物目标区域的反向引物和公共序列； 所述封闭引物包括所述公共序列的反向互补序列或部分反向互补序列。 2.根据权利要求1所述的用于构建微生物靶向测序文库的引物组合， 其特征在于， 所述 公共序列的反向互补序列包括所述公共序列的部分序列的反向互补序列或所述公共序列 的全部序列的反向互补序列。 3.根据权利要求1或2所述的用于构建微生物靶向测序文库的引物组合， 其特征在于， 所述封闭引物经 过封闭处 理； 优选地， 所述封闭处 理包括处 理所述封闭引物无法与游离dNTP连接； 优选地， 所述封闭处 理的位置包括3 ’端的C3位置； 优选地， 所述公共序列的长度为15～ 25bp； 优选地， 所述公共序列的核酸序列包括SEQ  ID NO.1所示的序列； 优选地， 所述第一标签序列包括特异性序列标签I5； 优选地， 所述第二标签序列包括特异性序列标签I7。 4.根据权利要求1 ‑3任一项所述的用于构建微生物靶向测序文库的引物组合， 其特征 在于， 所述微生物包括流感嗜血杆菌、 粘质沙雷氏菌、 鲍曼不动杆菌、 金黄 色葡萄球菌、 大肠 埃希菌、 卡他莫拉菌、 铜 绿假单胞菌、 肺炎克雷伯菌、 肺炎链球菌或嗜麦芽窄食单胞菌中的 任意一种或至少两种的组合； 优选地， 所述流感嗜血杆菌引物的核酸序列包括SEQ  ID NO.2～SEQ  ID NO.3、 SEQ  ID  NO.4～SEQ  ID NO.5或SEQ  ID NO.6～SEQ  ID NO.7所示的序列中的任意一对或至少两对的 组合； 优选地， 所述粘质沙雷氏菌引物的核酸序列包括SEQ  ID NO.8～SEQ  ID NO.9和/或SEQ   ID NO.10～SEQ  ID NO.11所示的序列； 优选地， 所述鲍曼不动杆菌的引物的核酸序列包括SEQ  ID NO.12～SEQ  ID NO.13和/ 或SEQ ID NO.14～SEQ  ID NO.15所示的序列； 优选地， 所述金黄色葡萄球菌的引物的核酸序列包括SEQ  ID NO.16～SEQ  ID NO.17、 SEQ ID NO.18～SEQ  ID NO.19或SEQ  ID NO.20～SEQ  ID NO.21所示的序列中的任意一对 或至少两对的组合； 优选地， 所述大肠埃希菌的引物的核酸序列包括SEQ  ID NO.22～SEQ  ID NO.23、 SEQ   ID NO.24～SEQ  ID NO.25或SEQ  ID NO.26～SEQ  ID NO.27所示的序列中的任意一对或至 少两对的组合； 优选地， 所述卡他莫拉菌的引物的核酸序列包括SEQ  ID NO.28～SEQ  ID NO.29和/或 SEQ ID NO.30～SEQ ID NO.31所示的序列；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115058490 A 2优选地， 所述铜绿假单胞菌的引物的核酸序列包括SEQ  ID NO.32～SEQ  ID NO.33和/ 或SEQ ID NO.34～SEQ  ID NO.35所示的序列； 优选地， 所述肺炎克雷伯菌的引物的核酸序列包括SEQ  ID NO.36～SEQ  ID NO.37、 SEQ   ID NO.38～SEQ  ID NO.39或SEQ  ID NO.40～SEQ  ID NO.41所示的序列中的任意一对或至 少两对的组合； 优选地， 所述肺炎链球菌的引物的核酸序列包括SEQ  ID NO.42～SEQ  ID NO.43、 SEQ   ID NO.44～SEQ  ID NO.45或SEQ  ID NO.46～SEQ  ID NO.47所示的序列中的任意一对或至 少两对的组合； 优选地， 所述嗜麦芽窄食单胞菌的引物的核酸序列包括SEQ  ID NO.48～SEQ  ID NO.49 和/或SEQ ID NO.50～SEQ ID NO.51所示的序列。 5.根据权利要求1 ‑4任一项所述的用于构建微生物靶向测序文库的引物组合， 其特征 在于， 所述接头引物中第一正向引物的核酸序列选自SEQ  ID NO.52～SEQ  ID NO.147所示 的序列中任意一种或至少两种的组合， 第一反向引物的核酸序列选自SEQ  ID NO.148～S EQ  ID NO.243所示的序列中任意 一种或至少两种的组合。 6.权利要求1 ‑5任一项所述的用于构建微生物靶向测序文库的引物组合在制备微生物 检测产品中的应用。 7.一种微生物检测试剂 盒， 其特征在于， 所述微生物检测试剂 盒包括权利要求1 ‑5任一 项所述的用于构建微 生物靶向测序文库的引物组合； 优选地， 所述试剂盒还 包括PCR反应液。 8.权利要求1 ‑5任一项所述的用于构建微生物靶向测序文库的引物组合在微生物检测 中的应用。 9.一种构建微 生物靶向测序文库的方法， 其特 征在于， 所述方法包括： 以待测样本中基因为模板， 利用权利要求1 ‑5任一项所述的用于构建微生物靶向测序 文库的引物组合进行PCR扩增， 纯化， 获得 所述微生物靶向测序文库。 10.一种微 生物检测方法， 其特 征在于， 所述 微生物检测方法包括以下步骤： (1)以待测 样本中基因为模板， 利用权利要求1 ‑5任一项所述的用于构建微生物靶向测 序文库的引物组合进行PCR扩增， 纯化， 获得 所述微生物靶向测序文库； (2)对所述 微生物靶向测序文库进行测序， 进行 数据分析。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115058490 A 3