(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211322242.3 (22)申请日 2022.10.27 (71)申请人 上海捷易生物科技有限公司 地址 201108 上海市闵行区春光路9 9弄18 号28号楼4楼 (72)发明人 颜进　陈珺　李艳艳　 (74)专利代理 机构 上海互顺专利代理事务所 (普通合伙) 31332 专利代理师 韦志刚　曹月明 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种用于新生儿免疫缺陷病筛查的试剂盒 及其制备方法 (57)摘要 本发明公开了一种用于新生儿免疫缺陷病 筛查的试剂盒及其制备方法， 所述试剂盒包括有 寡核苷酸序列组合、 阴性质控品和阳性质控品和 实时荧光PCR扩增的必要试剂Mg2+、 dNTPs、 DNA聚 合酶、 PCR缓冲液、 PCR增强剂等。 本申请通过设计 有通用引物Tag， 可以在多重荧光扩增体系中， 平 衡各引物对的扩增效率， 建立对ΔTREC和Δ KREC 的检测， 本申请检测的ΔTREC和ΔKREC指标， 相 比于定量TREC和K REC拷贝数， 具有受样本均一性 和核酸提取效率的影响较小， 检测成本低的优点 (不需要同步检测已知浓度的定量标准物质)， 同 时ΔTREC和ΔKREC在新生儿人群中的分布是正 态的， 具有更好的可预测性， 更适合于大规模筛 查应用。 权利要求书2页 说明书5页 附图4页 CN 115449549 A 2022.12.09 CN 115449549 A 1.一种用于新生儿免疫缺陷病筛查的试剂盒， 其特征在于： 所述试剂盒包括有寡核苷 酸序列组合、 阴性质控品和阳性质控品和实时荧光PCR扩增的必要试剂Mg2+、 dNTPs、 DNA聚 合酶、 PCR缓冲液、 PCR增强剂等； 所述寡核苷酸序列组合 为： (01)GCGTGAC CTACTGACTC； (02)GCGTGATGCATCGTAC C； (03)GCGTGAC CTACTGACTCTGCTGACAC CTCTGGTTTTTGTAA； (04)GCGTGATGCATCGTAC CACTCGTGAGA ACGGTGAATGAAG； (05)CCCACTCCTGTGCACG GTGATGCAT； (06)GCGTGAC CTACTGACTCAGCTCAGCGC CCATTACGTT； (07)GCGTGATGCATCGTAC CAGGAGCCAGCTCTTACCCTAGAGT； (08)GTGCACAGTGTGCGCTGC CAACC； (09)GCGTGAC CTACTGACTCG GCCATATTACTGACCCTCTACAGA； (10)GCGTGATGCATCGTAC CGAAAGATCAAAGCCTTGCAGGTAAT； (11)ACCACCTGCCTTTATCCTGCAATACCA； 所述序列01和序列02为通用引物Tag序列， 所述序列03、 04、 06、 07分别为连接有通用引 物Tag序列的靶 标特异的序列， 所述序列05、 08、 11为荧光探针序列并分别检测TREC、 KREC和 B2M基因， 所述序列05设计于TREC连接点处并横跨连接点两侧， 所述序列06设计于KREC连接 点处并横跨连接点两侧； 新生儿免疫缺陷病筛查包括以下步骤： 第一步： 准备寡核苷酸序列组合、 阴性质控品和阳性质控品和实时荧光PCR扩增的必要 试剂Mg2+、 dNTPs、 DNA聚合酶、 PCR缓冲液、 PCR增强剂等备用； 第二步： 阳性质控品使用293T细胞系与商品化红细胞和血浆按比例混合， 之后制备成 干血片； 第三步： 阴性质控品使用基因敲入的293T细胞系与商品化红细胞和血浆按比例混合 后， 之后制备成干血斑片； 第四步： 将第三步的基因敲入的293T细胞系， 可使用CRISPR技术将TREC特征序列和 KREC特征序列敲入2 93T细胞系； 第五步： 将上述材 料放置于试剂盒内即可。 2.根据权利要求1所述的一种用于新生儿免疫缺陷病筛查的试剂 盒， 其特征在于： 所述 序列05、 08、 11的荧光报告基团可互不干涉地选自FAM、 HEX、 VIC、 ROX、 JOE、 CY3、 CY5、 CY5.5、 TET和5‑TAMRA等， 所述序列05、 08、 11的荧光报告基团可根据荧光报告集团的匹配性选自 BHQ0、 BHQ1、 BHQ2、 BHQ3、 MGB、 Dabcyl、 TAMRA等。 3.根据权利要求1所述的一种用于新生儿免疫缺陷病筛查的试剂盒制备方法， 其特征 在于： 所述第五步中TRE C特征序列为： GCTCTGAAAGGCAGAAAGAGGGCAGCCCTCTCCAAGGCAAAATGGGGCTCCTGTGGGGAACAGAGGGGTGCC TCTGTCAACAAA GGTGATGCCACATCCCTTTCAACCATGCTGACACCTCTGGTTTTTGTAAA GGTGCCCACTCCTG TGCACGGTGATGCATA GGCACCTGCACCCCGTGCCTAAACCCTGCA GCTGGCACGGGCCCTGTCTGCTCTTCATTC ACCGTTCTCACGAGTTGCAATAA GTTCAGCCCTCCATGTCACACTGTGTTTTCCATCCTGGGGA GTGTTTCACA GC权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115449549 A 2TATCCCAAGCCCCACGCTGA。 4.根据权利要求1所述的一种用于新生儿免疫缺陷病筛查的试剂盒及其制备方法， 其 特征在于： 所述第五步中KRE C特征序列为： TGGAAATTTTCACTAATGAGATATCATAATGAATGTGAATTTTATTTCTGAAATCTCTAATAAATCAGTCTT CTCCCTGGTTTTCCCA GCTCAGCGCCCATTACGTTTCTGTTCTCTTTCCCTTA GTGGCATTATTTGTATCACTGTG CACAGTGTGCGCTGCCAACCTGCTGCCCGTGCA GAAACTCTA GGGTAAGAGCTGGCTCCTGGAGTCCCACCCA GGC TGCGTGTC CCTCACAGTCTGCTCTGTGTCTATGTGTGTGTGT TGGGGGGATATTATTGGACAATTCAAGGGAGGCT。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115449549 A 3