(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211001610.4 (22)申请日 2022.08.19 (71)申请人 杭州迅灵生物科技有限公司 地址 310000 浙江省杭州市滨江区长河街 道滨安路68 8号2幢E楼三层3 05室 (72)发明人 金霞　胡彬　刘杰　杨钦　黄文莺　 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种猫杯状病毒LAMP荧光检测组合物及其 LAMP荧光检测法 (57)摘要 一种猫杯状病毒LAMP荧光检测组合物， 由正 向内引物FIP、 反向内引物BIP、 正向外引物F3、 反 向外引物B3、 反向环引物LB与探针LF、 LF ‑Q组成， 本发明还涉及一种猫杯状病毒 LAMP荧光检测法， 本发明提供的组合物可以进行LAMP荧光检测和 试纸条双重 检测， 节约成本和时间。 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 115386657 A 2022.11.25 CN 115386657 A 1.一种猫杯状病毒LAMP荧光检测组合物， 其特征在于， 由正向内引物FIP、 反向内引物 BIP、 正向外引物F3、 反向外引物B3、 反向环引物LB与探针LF、 LF ‑Q组成； 各引物序列具体如 下： FIP: 5’ ‑TGGCGGGTAGTTCGTCTAACCT‑TGGTTCACCTGTGCCACTA‑3’； BIP: 5’ ‑（bio） GGTGTTTGATTTGGCCTGGGC‑TGGCTTGAAACTGTCCTGTT‑3’； F3: 5’ ‑TCCGCACTAG GTGTGTGTA ‑3’； B3: 5’ ‑CACATCATATGCG GCTCTGA‑3’； LB: 5’ ‑TCTTCGCCGTCACCTGAC‑3’； LF: 5’ ‑（FAM） GTCAGTGCAGGCTCCCGTACGCTATCATTGACAATCT(THF)CCCTTAATG ‑‑3’  （C3‑ SPACER） ； LF‑Q： 5’ ‑ACGGGAGCCTGCACTGAC ‑3’（BHQ1） 。 2.根据权利要求1所述的一种猫杯状病 毒LAMP荧光检测组合物， 其特征在于， 所述探针 LF与LF‑Q替换为LF’， 其中LF’的序列为： LF: 5’ ‑（BHQ1） ATTGCGGGAGATGAGACCCGCAA （FAM ‑dT） ACGCTATCATTGACAATCT(THF) CCCTTAATG‑3’  （C3‑SPACER） 。 3.根据权利要求1或2所述的一种猫杯状病毒LAMP荧光检测组合物， 其特征在于： 所述 反向内引物BIP设有生物 锁。 4.一种猫杯状病毒LAMP荧光检测法， 其特征在于， 采用权利要求3所述的猫杯状病毒 LAMP荧光检测组合物， 具体 检测方法如下： 12.5ul 2×buffer （1.6M甜菜碱， 40  mM Tris‑HCl (pH 8.8), 20 mM KCl, 20 mM  (NH4)2SO4,  and 0.2% Tween 20)， 5 pmol F3 ， 5pmol B3, 40 pmol FIP primers， 40   pmol biotin‑BIP， 16pmol  LB， 16pmol  LF和16pmol的LF ‑Q 1ul Bst 2.0 DNA polymerase， 8.4 mM MgSO4， 1.2 uM dNTPs ， 1ul Endo IV ， 1ul AMV， 加入模板2ul， 其余加水补充至 25ul； 放置在GS8恒温荧光PCR仪器中， 20cycles  60℃ 60s 读取FAM荧光， 反应结束后取10ul 的产物加入190ul的水中， 振荡混匀， 滴管 取约60ul液体加入核酸试纸条中， 5mi n观察结果。 5.根据权利要求4所述的一种猫杯状病毒LAMP荧光检测法， 其特征在于， 将所述的 16pmol LF和16pmo l的LF‑Q替换为16pmo l LF’。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115386657 A 2一种猫杯状病毒LAMP荧光检测组合物及其LAMP荧光检测法 技术领域 [0001]本发明涉及 猫杯状病毒LAMP检测技术领域， 尤其涉及一种猫杯状病毒LAMP 荧光检 测组合物及其 LAMP荧光检测法。 背景技术 [0002]自1980年PC R技术发明后， 基于PC R技术的核酸检测迅速应用到临床、 食品、 环境的 检测中， 并成为核酸检测的金标准。 但P CR的检测技术存在设备体积大、 粗样品耐受性差、 反 应时间长、 灵敏度难以达到单copy等诸多缺点， 已经难以满足现代核酸检测的要求： 速度快 （<30min） 、 超灵敏度 （1 ‑5copy/test） 、 大体积粗制样品直检 （20 ‑50%反应体积样本量） 、 野外 操作、 简单化操作等方面的指标。  在过去的20年中科学家 一直尝试通过恒温扩增的方法来 实现上述 目标， 这其中包括RCA(rolling  circle amplification)、 LAMP(loop ‑mediated   isothermal  amplification)、 RPA(recombinase  polymerase  amplification)、 NASBA (nucleic  acid sequence  based amplification)、 SDA(strand  displacement   amplification)、 HDA  (helicase  dependent  amplification)、 TMA(transcription ‑ mediated  amplification)等新型核酸恒温扩增技 术。 [0003]在这些恒温扩增技术中， 以2000年首次报道的LAMP法尤为耀眼和引人关注， 目前 占据超过60%的恒温检测市场。 核酸检测对LAMP技术如此亲赖， 究其原因， 得益于其它恒温 检测技术难以达 到LAMP技 术的综合 性优势： 1、 反应速度极快， 优化的引物组合可以达到 15min内检测到单copy分子， 检测速度 接近或超过RPA和NASBA； 能够达到超敏检测极限， 1 ‑5copy的分子能够稳定检出， 稳定性极高， 其它任何恒 温技术难以达 到如此稳定的水平； 2、 结果判读形式的多样化， 适应各种环境和条件下的核酸快速检测。 LAMP扩增作 为终点判读形式， 可不借助任何其它辅助设备， 裸眼观察检出结果。 基于钙黄绿素、 HNB、 红 黄变色、 OG橙绿变 色都可以肉 眼观察结果。 LAMP同样可借助浊度仪进行实时浊度分析。 在反 应体系中加入SYBR  Green荧光染料后， 可使用小型恒温荧光仪进行实时检测 。 以上这些结 果判读形式均可在 野外等非标准实验室进 行， 所需设备简单、 小巧、 价格低廉、 便于普及。 除 此外， 传统实验室中的荧光定量PCR仪， 同样可进行LAMP检测， 可采用SYBR  Green、 MB探针 法 或LAMP TaqMan探针法， 对于经常操作PCR检测的人员来讲， 可以无 缝对接、 无需更 换设备。 [0004]3、 对RNA病毒的漏检率低， 由于RNA病毒的突变率较高， 在PCR检测中个别突变对 PCR的扩增影响较大， 容易造成病毒漏检的假阴性。 而LAMP识别靶基因8个区段， 在这些识别 区段中个别的突变对LAMP扩增影响较小， 不 易产生漏检。 [0005]4、 试剂稳定、 易于使用。 同RPA、 NASBA等技术相比， LAMP与PCR法都采用单一酶 （或 双酶） 系统进 行反应， 生产批次稳定、 反应酶系统耐 高温， 试剂稳定性好。 在检测试剂中仅包 含酶mix一管、 引物/探针一管， 使用方便， 在荧光定量P CR机器上可方便的进 行高通量检测。 而RPA、 NASBA 等系统需要多个复合 酶， 比例严谨、 试剂稳定生产困难、 保存运输条件苛刻、 难说　明　书 1/4 页 3 CN 115386657 A 3