(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210646130.7 (22)申请日 2022.06.08 (71)申请人 河北三狮生物科技有限公司 地址 050000 河北省石家庄市高新区黄河 大道136号石家庄科技中心 2号楼2215 (72)发明人 时国强　石磊　焦义然　张婵　 董振国　 (74)专利代理 机构 河北国维致远知识产权代理 有限公司 13137 专利代理师 任青 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种特异性检测鲤浮肿病毒的引物和探针 及其应用 (57)摘要 本发明涉及生物病毒检测技术领域， 具体公 开一种特异性检测鲤浮肿病毒的引物和探针及 其应用。 检测鲤浮肿病毒的引物和探针中， 内引 物FIP的序列如SEQ  ID NO:1， 内引物BIP的序列 如SEQ ID NO:2， 外引物F3的序列如SEQ  ID NO: 3， 外引物B3的序列如SEQ  ID NO:4， 环引物探针 的序列如SEQ  IDNO:5。 利用本发明的引物和探 针， 可实现对鲤浮肿病毒的准确检测， 避免非特 异性扩增导致的假阳性结果的出现， 最低检测限 可达0.5copies/μL， 更有利于鲤浮肿病毒的早 期检测， 从而避免疾病的扩散， 对于水产疫病的 防治具有十分重要的意 义。 权利要求书1页 说明书6页 附图3页 CN 114807451 A 2022.07.29 CN 114807451 A 1.一种特异性检测鲤浮肿病毒的引物和探针， 其特 征在于， 包括： 内引物FIP： 5 ′ ‑GTTCATTCTCAAATGGTTGCAACACTGCCATTACGTAATTAGAATCG‑3′； 内引物BIP： 5 ′ ‑AGTTGATATGCT TTTGCATTTGCAAGAAGCTCTACT TTGTCTCA‑3′； 外引物F3： 5 ′ ‑ATGGATTTGCTGCTG GTG‑3′； 外引物B3： 5 ′ ‑GCTTCTCAAGATATACAT TACACA‑3′； 环引物探针LBP： 5 ′ ‑GCAACAACTTGACGAGGGAATGAT‑3′。 2.如权利要求1所述的特异性检测鲤浮肿病 毒的引物和探针， 其特征在于， 所述环引物 探针LBP为： FAM ‑5′ ‑GCAACAACTTGACGAGGGAATGAT‑3′BHQ。 3.一种用于特异性检测鲤浮肿病 毒的试剂 盒， 其特征在于， 包含权利要求1 ‑2任一项所 述的引物和探针。 4.如权利要求3所述的用于特异性检测鲤浮肿病 毒的试剂 盒， 其特征在于， 包括预反应 液、 阳性对照液和阴性对照液， 其中， 所述预反应液包括基础缓冲液、 氯化钾溶液、 硫酸铵 溶 液、 Trito n X‑100、 DNA聚合酶、 甜菜碱、 氯化镁溶 液、 dTNPs和去离 子水。 5.如权利要求4所述的用于特异性检测鲤浮肿病 毒的试剂 盒， 其特征在于， 所述阴性对 照液为ddH2O。 6.如权利要求4所述的用于特异性检测鲤浮肿病 毒的试剂 盒， 其特征在于， 所述阳性对 照液的浓度为5 ×104copies/ μL。 7.利用权利要求3所述的试剂盒检测鲤浮肿病毒的方法， 其特征在于， 具体操作为： 提 取鲤浮肿病毒的核酸 为模板， 用所述试剂盒进行进行实时荧 光定量PCR扩增检测。 8.如权利要求7所述的检测鲤浮肿病毒的方法， 其特征在于： PCR扩增的体系包括以下 试剂及用量： pH8.3  Tris‑HCl 20mmol， KCl  10mmol， (NH4)2SO410mmol， Tr iton X‑100 0.025 μL， Bst DNA聚合酶8U， Taq  DNA polymerase  2.5U， 甜菜碱1mol， MgCl2 8mmol， dNTPs   2.0mmol， 内引物FIP  2.0 μmol， 内引物BIP  2.0 μmol， 外引物F3  0.25 μmol， 外引物B3  0.25 μ mol， 环引物探针LBP  0.25 μmol， 去离子水补足至23 μL。 9.如权利要求7所述的检测鲤浮肿病毒的方法， 其特征在于： PCR扩增的反应温度为62 ℃‑64℃， 反应时间为5 0min‑55min。 10.如权利要求9所述的检测鲤浮肿病毒的方法， 其特征在于： PCR扩增的反应温度为63 ℃， 反应时间为5 0min。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114807451 A 2一种特异性检测鲤浮肿病毒 的引物和探针及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及 生物病毒检测技术领域， 尤其涉及一种特异性检测鲤浮肿 病毒的引物 和探针及其应用。 背景技术 [0002]鲤鱼是全球养殖最广泛的鱼类， 鲤浮肿病、 锦鲤疱疹病毒病、 鲤鱼春病毒血症是目 前主要的病毒病， 给世界各国养殖业造成了重大经济损失。 我国于2016年首次发现鲤浮肿 病毒(CEV)， 具有爆发强、 传染快、 死亡率高等特点。 2018年全国水产技术推广总站 开展的水 生动物疫病监测结果显示， 鲤浮肿病阳性检出率为 12.9％。 鲤浮肿病在我国已广泛流行， 其 爆发后单个池塘累计死 亡率高达 50‑80％， 严重影响国内鲤科鱼类养殖 行业的健康发展。 [0003]目前， 国内外对鲤浮肿病毒的检测研究较少， 主要CEV的检测方法为荧光PC R法、 套 式PCR法、 琼脂糖电泳法和LAMP法等。 但是， 现有检测方法仍存在操作复杂、 检测时间长、 易 因非特异性扩增产生假阳性结果等明显缺陷， 极大地限制了这些方法在鲤浮肿病毒检测中 的应用及推广。 因此， 发展一种简便、 高特异性、 避免假阳性检测的高灵敏度鲤浮肿病毒的 快速检测方法， 对早期防治鲤浮肿病毒具有十分重要的意 义。 发明内容 [0004]针对现有鲤浮肿病毒的检测方法存在的假阳性概率高、 检测时间长、 灵敏度较低 等问题， 本发明提供一种 特异性检测鲤浮肿病毒的引物和探针及其应用， 利用该检测鲤浮 肿病毒的引物和探针可在恒温条件下快速检测鲤浮肿病毒， 且可完全避免假阳性检测结果 的出现， 特异性好、 灵敏度高， 有利于实现对鲤浮肿病毒的早期防治， 从而有效预防疾病的 扩散， 减少养殖户的经济损失。 [0005]为达到上述发明目的， 本发明实施例采用了如下的技 术方案： [0006]一种特异性检测鲤浮肿病毒的引物和探针， 包括： [0007]内引物FIP： 5 ′ ‑GTTCATTCTCAAATGGTTGCAACACTGCCATTACGTAATTAGAATCG ‑3′(SEQ  ID NO:1)； [0008]内引物BIP： 5 ′ ‑AGTTGATATGCTTTTGCATTTGCAAGAAGCTCTACTTTGTCTCA ‑3′(SEQ ID  NO:2)； [0009]外引物F3： 5 ′ ‑ATGGATTTGCTGCTG GTG‑3′(SEQ ID NO:3)； [0010]外引物B3： 5 ′ ‑GCTTCTCAAGATATACAT TACACA‑3′(SEQ ID NO:4)； [0011]环引物探针LBP： 5 ′ ‑GCAACAACTTGACGAGGGAATGAT‑3′(SEQ ID NO:5)。 [0012]相对于现有技术， 本发明提供的特异性检测 鲤浮肿病毒的引 物和探针， 可以特异 性结合到鲤浮肿病毒的核酸上， 准确检测出鲤浮肿病毒， 且通过设计一条环引物， 并将环引 物设计为环引物探针LBP， 不但减少了非特异性扩增， 避免了假阳性检测结果的出现， 还提 高了鲤浮肿病毒的检测灵敏度， 对鲤浮肿病毒的最低检测限可达0.5copies/ μL。 本发明提 供的引物和探针， 与金鱼造血器官坏死病毒、 鲤鱼春病毒血症病毒、 草鱼 呼肠孤病毒、 鲤鱼说　明　书 1/6 页 3 CN 114807451 A 3