(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210761197.5 (22)申请日 2022.06.30 (71)申请人 上海纳米技 术及应用国家工程研究 中心有限公司 地址 201109 上海市闵行区剑川路468号 申请人 国纳纳米技术研究 （河北） 有限公司 (72)发明人 崔大祥　李雪玲　田静　仲禺俊　 沈琦　 (74)专利代理 机构 上海东亚专利商标代理有限 公司 31208 专利代理师 董梅 (51)Int.Cl. C12Q 1/6844(2018.01) C12Q 1/689(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/445(2006.01) (54)发明名称 一种滑石 粉金黄色葡萄球 菌的检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种滑石粉金黄色葡萄球菌 的检测方法， 包括取样； 样品稀释： 在增菌 液中增 菌； 提取基因组DNA， 包括但不限于为CTAB法、 酸 裂解法、 碱裂解法以及商业试剂盒法； 以基因组 DNA为模板， 以能扩增金黄色葡萄球菌基因组特 异性碱基序列的引物组为引物， 在等温扩增反应 体系中进行反应， 所述等 温扩增反应体系包括聚 合酶反应缓冲液， Mg2+， dNTP， 引物组Bst  DNA聚 合酶和甜菜碱中的一种或多种； 扩增结果检测方 法包括但 不限于电泳检测、 浊度检测或显色检测 中的一种， 通过判断反应结果是否为阳性， 确定 待测样品中是否存在金黄色葡萄球菌。 本发明方 法具有良好的金黄色葡萄球菌菌株特异性， 操作 简便、 检测时间短、 效果极佳， 非常适于化工、 建 材等领域推广使用。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图1页 CN 115029419 A 2022.09.09 CN 115029419 A 1.一种滑石粉金黄色葡萄球菌的检测方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： （1） 滑石粉取样； （2） 样品稀释： （3） 在增菌液中增菌； （4） 提取基因 组DNA， 包括但不限于为CTAB法、 酸裂解法、 碱裂解法以及商业试剂盒法； （5） 以基因组DNA为模板， 以能扩增金黄色葡萄球菌基因组特异性碱基序列的引物组为 引物， 在等温扩增反应体系中进行等温扩增反应， 所述等温扩增反应体系包括聚合酶反应 缓冲液， Mg2+， dNTP， 引物组Bst  DNA聚合酶、 石蜡 块中的一种或多种； （6） 扩增结果检测方法包括但不限于电泳检测、 浊度检测或显色检测中的一种， 通过判 断反应结果是否为阳性， 确定待测样品中是否存在金黄色葡萄球菌 。 2.根据权利要求1所述的滑石粉金黄色葡萄球菌的检测方法， 其特征在于， 所述的取样 为， 每批滑石粉应随机抽两个或两个以上包 装完好的单位， 试样量 不少于10g。 3.根据权利要求1所述的滑石粉金黄色葡萄球菌的检测方法， 其特征在于， 所述的样品 稀释为称取10.0g试样， 放入装入90mL稀释剂和玻璃珠的容器中， 混匀制成1： 10稀释液， 所 述的稀释剂为氯化钠 ‑蛋白胨缓冲液。 4.根据权利要求3所述的滑石粉金黄色葡萄球菌的检测方法， 其特征在于， 氯化钠 ‑蛋 白胨缓冲液的配方为： 蛋白胨20g、 氯化钠5g和蒸馏水1000mL， 将各组分加热溶解后， 调pH值 为7.0‑7.2， 在121℃高压灭菌15mi n。 5.根据权利要求1所述的滑石粉金黄色葡萄球菌的检测方法， 其特征在于， 所述的增菌 为取上述1： 10稀释液10mL放入装有增菌液的容器中， 36℃ ±1℃培养18 ‑24小时， 其中， 所述 增菌液为细菌 培养液。 6.根据权利要求1所述的滑石粉金黄色葡萄球菌的检测方法， 其特征在于， 所述的细菌 培养液包括： 7.5%氯化钠肉汤、 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤、 NB培 养液、 LB培 养液。 7.根据权利要求6所述的滑石粉金黄色葡萄球菌的检测方法， 其特征在于， 所述的7.5% 氯化钠肉汤的配方为： 蛋白胨10g、 牛肉膏3g、 氯化钠75g、 蒸馏水1000mL， 将各 组分加热溶解 后， 调pH值 为7.2‑7.4， 在121℃高压灭菌15mi n。 8.根据权利要求1所述的滑石粉金黄色葡萄球菌的检测方法， 其特征在于， 所述等温扩 增反应体系为： 1 × Bst DNA聚合酶反应缓冲液， 2 ‑9mmol/L Mg2+（MgSO4或MgCl2） ， 1.0‑ 1.6mmol/L  dNTP， 0.15‑0.3µmol/L的F3和B3引物， 0.8 ‑2.0µmol/L的FIP和BIP引物， 0.16 ‑ 0.64U/ μL  Bst DNA聚合酶、 0 ‑1.5mol/L甜菜碱， 在25 µL的核酸扩增反应体系中石蜡块融化 后的体积为8 µl优化体系。 9.根据权利要求1或8所述的滑石粉金黄色葡萄球菌的检测方法， 其特征在于， 所述的 能扩增金黄色葡萄球菌基因 组特异性碱基序列的引物组为： F3： 5’ ‑  TAAAGCCACATCCAATATAG  ‑3’  （SEQ ID NO： 1） ； B3： 5’ ‑  TGCCTTACATTGATGCTG  ‑3’  （SEQ ID NO： 2） ； FIP： 5’ ‑  GTCGTTGGTGAGCAATTGAGGAGTATCGT TCCAGATTTGTGA  ‑3’； （SEQ ID NO： 3） ； BIP： 5’ ‑  CGACTAGGGGTAGTAATCATTGGCCACTTTGCTATGGAACGTAAC  ‑3’  （SEQ ID NO： 4） 。 10.根据权利要求1所述的滑石粉金黄色葡萄球菌的检测方法， 其特征在于， 所述等温 扩增反应的反应程序为 ①65℃孵育60min；②80℃终止反应5mi n。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115029419 A 2一种滑石粉金黄色葡萄球菌的检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于生物化工领域， 具体涉及一种滑石粉金黄色葡萄球菌的检测方法。 背景技术 [0002]滑石粉是一种工业产品， 为硅酸镁盐类矿物滑石族滑石， 主要成分为含水硅酸镁， 经粉碎后， 用盐酸处理， 水洗， 干燥而成， 常用于食品、 医药、 化妆品、 橡胶、 塑料、 油漆等多个 行业。 [0003]金黄色葡萄球菌 （ Staphylococcus  aureus） 隶属于葡萄球菌属， 菌体球形， 是一种 革兰氏阳性细菌， 可引起人类化脓感染、 肺炎、 伪膜性肠炎、 心包炎等， 甚至败血症、 脓毒症 等疾病。 同时其产生的肠毒素可污染食物而致食物中毒， 是评价食品等质量标准的必检项 目之一。 包括金黄色葡萄球菌在内的微生物检验也是滑石粉质量评价的重要内容。 虽然有 针对食品金黄 色葡萄球菌的快速检测方法， 但目前对于滑石粉中金黄 色葡萄球菌的检测操 作繁琐， 用时长 （至少需要3天， 如JC/T  542） ， 因此， 需要一种能够 对滑石粉 金黄色葡萄球菌 快速检测的方法。 [0004]本发明提供了一种滑石粉金黄色葡萄球菌的检测方法， 能够对滑石粉这一重要工 业产品中的金黄色葡萄球菌进行 快速检测。 发明内容 [0005]本发明要解决的技术问题在于克服现有滑石粉金黄色葡萄球菌检测操作繁琐、 用 时长的问题， 提供一种滑石粉金黄色葡萄球菌的检测方法。 [0006]本发明基于环介导等温扩增反应原理来实现优化效果， 提供了采用本发明的方法 进行检测， 具有方便、 快速的优点。 [0007]本发明提供一种滑石粉金黄色葡萄球菌 的检测方法， 其特征在于， 所述方法包括 如下步骤： （1） 取样； （2） 样品稀释： （3） 在增菌液中增菌； （4） 提取基因 组DNA； （5） 以基因组D NA为模板， 以能扩增金黄色葡萄球菌基因组特异性碱基序列的引物 组为引物， 在等温扩增反应 体系中进行反应； （6） 通过判断反应结果是否为阳性， 确定待测样品中是否存在金黄色葡萄球菌 。 [0008]本发明提供一种滑石粉金黄色葡萄球菌的检测方法， 其特征在于， 所述的取样为， 每批滑石粉应随机抽两个或两个以上包 装完好的单位， 试样量 不少于10g。 [0009]本发明方法 中， 所述的样品稀释为称取10.0g试样， 放入装入90mL稀释剂和玻璃珠 的容器中， 混匀制成1： 10稀释液。 [0010]本发明方法中， 所述的稀释剂为氯化钠 ‑蛋白胨缓冲液。 其中氯化钠 ‑蛋白胨缓冲说　明　书 1/4 页 3 CN 115029419 A 3